[发明专利]一种荧光化合物、荧光修饰核苷酸、试剂盒

说明书

本发明涉及有机化合物试剂技术领域，具体涉及一种荧光化合物、荧光修饰核苷酸、试剂盒，其中荧光修饰核苷酸能够应用于边合成边测序的核酸测序反应。本发明创造性的改进‑CORsubgt;11/subgt;‑与荧光化合物核心结构之间的连接结构，采用含有醚键的杂烷基结构‑(CHsubgt;2/subgt;)subgt;m/subgt;‑O‑(CHsubgt;2/subgt;)subgt;n/subgt;‑作为连接结构将连接基‑CORsubgt;11/subgt;‑连接至荧光化合物核心结构，提高荧光化合物作为修饰分子形成的修饰核苷酸用作核酸测序反应过程中的聚合酶亲和力，提高掺入效率，同等掺入效率需求条件下，降低试剂用量，降低试剂成本。

技术领域

本发明涉及有机化合物试剂技术领域，具体涉及一种荧光化合物、荧光修饰核酸、试剂盒，荧光修饰核苷酸应用于核酸测序。

背景技术

已发现荧光染料作为检测标记广泛用于分子生物学、细胞生物学和分析遗传学的用途。例如，荧光-标记的寡核苷酸现在在多种不同试验中被使用，包括核苷酸测序、荧光原位杂交、基于核苷酸阵列的杂交试验、荧光极化研究和核酸扩增试验。

DNA测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的基本原理是边合成边测序，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

然而，采用不同颜色荧光标记核苷酸进行多重荧光检测存在限制荧光标记物选择的多重因素。首先，由于染料的吸收带通常被宽泛的分开，当若干荧光染料一起使用时，需要选择能够被合适的光谱分辨的染料化合物结合使用，并且需要考虑尽量扩大不同荧光染料发光信号的可区分性；其次，由于许多激发方法采用高功能激光，因此需要染料化合物具有足够的光稳定性以经受检测过程中的激光激发；另外，最重要的是需要考虑荧光染料必须与使用的其他试剂如缓冲液、聚合酶、连接酶等是相容的，尤其是需要荧光染料修饰后的核酸是聚合酶能够识别的。并且随着测序技术的不断发展，人们研究发现具有改进的荧光性质（例如荧光强度、荧光最大值的位置以及荧光带的形状）的荧光染料分子可以改进核酸测序的速度和准确性。由于测序反应的缓冲液环境、测序反应的温度环境以及核酸的碱基结构等均会影响荧光化合物的发光性能，比如荧光最大值、荧光强度等。由此，人们逐渐开始通过调整和改进荧光化合物的结构，提高荧光化合物与核碱基之间的序列特异性作用性能，进而提高荧光化合物在测序过程中的发光性能。同时，通过荧光化合物结构的改进，提高修饰核苷酸的荧光性能，提高修饰核酸并入的效率，降低测序的误差水平并且减少核酸测序中试剂的使用，降低核酸测序的成本，成为了研究热点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种荧光化合物，能够作为核酸测序的修饰核酸的荧光修饰结构，提高荧光修饰核酸的聚合酶亲和力，提高掺入效率。

本发明的目的之二是提供连接本发明荧光化合物进行修饰的荧光修饰核苷酸，应用于边合成边测序系统，提高修饰核酸的掺入效率。

同时，本发明还在于提供一种试剂盒，包含本发明提供的荧光修饰核苷酸，应用于核酸测序。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种荧光化合物，具有式（Ⅰ）所示的化学结构通式：