[发明专利]一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光型RAA试剂盒及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光型RAA试剂盒及其检测方法和应用。该试剂盒包括特异性引物HW‑LSD‑F和HW‑LSD‑R，以及RAA‑exo探针HW‑LSD‑LP。本发明提供的试剂盒利用等温扩增反应，在37～42℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，可在20min内实现牛结节性皮肤病病毒的检测，特异性为100％，检测敏感性为12copies/μL。本发明中的试剂盒操作简单、快速、灵敏，为牛结节性皮肤病病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制牛结节性皮肤病病毒的传播具有非常重要意义。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光型RAA试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)是一种牛痘病毒病，由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起，又被称为“牛疙瘩皮肤病”或“牛结节疹”，可引起牛皮肤、黏膜和内脏组织出现结节，淋巴结节增大、发热、食欲不振、消瘦等症状。该病可使母牛暂时性泌乳减少、公牛暂时性或永久不育、继发细菌感染导致死亡，由此给养牛业带来较大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为法定通报的动物疫病，属于《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类动物传染病，农业农村部暂时将其作为二类动物疫病管理。

重组酶介导链替换核酸扩增技术(Recombinase-aid Amplification，RAA)，是一种恒温核酸快速扩增技术。RAA利用从细菌或真菌中获得的重组酶，该重组酶在常温下可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记、生物素标记的引物和核酸内切酶酶切，可以实现定时定量的结果分析，通常20min就可以得到荧光检测结果。

目前，LSD尚无有效疫苗预防及治疗方法，短期内，依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制，采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。OIE推荐的HAD、ELISA、IFA等血清学检测方法，耗时长，操作复杂，不适用于牛结节性皮肤病病毒的快速检测。因此，亟需开发出一种操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低、适用于牛结节性皮肤病病毒的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性引物组；

本发明的另一目的在于提供一种RAA-exo探针；

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂；

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒；

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的使用方法；

本发明的另一目的在于提供上述特异性引物组和/或上述RAA-exo探针在制备牛结节性皮肤病病毒检测制剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

特异性引物组，该特异性引物组特异性用于扩增牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF132基因；

其中，上述特异性引物组的核苷酸序列如下所示：

HW-LSD-F：5′-TATAMTGGTCTATTTTTAACTTTTTTATGCAAT-3′(SEQ ID NO.1)；

HW-LSD-R：5′-GARAACAACACTTTTTCCTTATCTAAAGAGRC-3′(SEQ ID NO.2)。

其中，根据本领域常识，M和R均为简并碱基，M指A或C，R指A或G。