[发明专利]一种细胞株冻存复苏的保护液及制备方法

说明书

本发明公开了一种细胞株冻存复苏的保护液及制备方法，制备方法包括以下步骤：将RPMI‑1640培养基按溶液体积每200ml加入0.005g重组人源性蛋氨酸亚砜还原酶A和15mg二硫苏糖醇，得到0.005％的蛋氨酸亚砜还原酶A溶液的保护液。本发明通过在常温条件下快速清除细胞冻存液中残余的二甲基亚砜，消除二甲基亚砜对复苏后细胞株的损伤，可显著提升细胞株冻存后复苏的活性，提高实验的成功率。

技术领域

本发明涉及细胞保护液技术领域，特别涉及一种细胞株冻存复苏的保护液及制备方法。

背景技术

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。细胞株的冻存和复苏是细胞生物学最常见的实验技术之一，广泛应用于生命科学和医学的各项科学研究或技术应用中。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候又可以再复苏细胞用于实验。而且，冻存一定量的细胞，可防止因正在培养的细胞被污染或其他原因而使细胞丢种，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。

细胞冻存的关键是向培养基中加入冷冻保护剂，一般常用二甲基亚砜(DMSO)，使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。常用的细胞冻存液的配方有：传统细胞冻存液的配制比例主要为30％的血清+60％的细胞培养基+10％DMSO；而融合瘤细胞、淋巴细胞一般采用90％细胞培养基+10％DMSO等。

DMSO此类渗透性保护剂，可以有效减少冻存过程中冰晶形成对细胞的损伤。但是，复苏过程中冻存液里的DMSO和复苏后细胞培养基里的残留DMSO往往对细胞会有一定的毒性作用，影响复苏后细胞的活性和后续试验的开展复苏过程中冻存液里的DMSO和复苏后细胞培养基里的残留DMSO往往对细胞会有一定的毒性作用，影响复苏后细胞的活性和后续试验的开展。另外有些重要的细胞对于DMSO非常敏感(造血干细胞、原代培养神经细胞等)，使用含DMSO的细胞冷冻液可能会影响细胞的功能。更重要的是，随着临床上细胞疗法使用的逐渐增加，DMSO的潜在毒性如引起DNA突变、蛋白变性等，可能带来DMSO冻存的细胞在临床应用中的副作用，如腹泻以及神经系统、呼吸系统等组织损伤。

由于在冻存液中，DMSO的浓度为10％；复苏后，如不进行离心处理除去DMSO，而直接使用培养瓶或培养板培养细胞，残留的DMSO浓度也达到1％-3％；为降低DMSO的毒性，通常采用降低冻存液中DMSO的含量以及复苏后洗涤离心除去DMSO残留这两种办法。但降低DMSO含量有可能影响冻存效果，增加冻存中细胞死亡；而通过洗涤离心除去DMSO的操作对新复苏细胞的状态会有较大影响，并且可能导致细胞结块或细胞污染，且无法去除细胞内的DMSO，残留的细胞内DMSO仍然可能影响细胞状态。目前，市场上无DMSO的细胞冻存液价格高昂、配方保密。因此，我们希望能为设计一种新型冻存液提供新思路——既不影响DMSO在冻存时保护细胞的功能，同时减少复苏冻存细胞时DMSO的毒性作用。

发明内容

为了至少解决或部分解决上述问题，提供一种细胞株冻存复苏的保护液及制备方法，该保护液通过在常温条件下快速清除细胞冻存液中残余的二甲基亚砜，消除二甲基亚砜对复苏后细胞株的损伤，可显著提升细胞株冻存后复苏的活性，提高实验的成功率。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

本发明一种细胞株冻存复苏的保护液，由含有重组大鼠源性或人源性蛋氨酸亚砜还原酶A0.001％-0.005％；二硫苏糖醇0.0005-0.002％；余量为RPMI-1640培养基组成。

本发明一种细胞株冻存复苏的保护液的制备方法，包括以下步骤：将RPMI-1640培养基按溶液体积每200ml加入0.005g重组人源性蛋氨酸亚砜还原酶A和15mg二硫苏糖醇，得到0.005％的蛋氨酸亚砜还原酶A溶液的保护液。

作为本发明的一种优选技术方案，将配置好的保护液在无菌条件下过滤后分装保存，冻存细胞复苏后，按1:100–1:50比例加入细胞株冻存液和复苏细胞的培养基中。