[发明专利]皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法

权利要求书

1.一种皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，包括：

获取皱纹盘鲍的肝胰腺；

采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理并进行过筛，得到过筛液；

对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液；

将所述细胞悬液接种到六孔细胞培养板中，采用膜封口后置于培养箱中，每2d更换一次鲍细胞的完全培养基；

所述对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液，包括：

收集过筛液，采用转速为1000rpm，持续时间为3min，弃上清液后，用完全培养基对沉淀重悬并重复离心两次，取沉淀；

将所述沉淀重悬，其采用600rpm离心2min，弃上清液后取沉淀；

用完全培养基将得到的沉淀重悬，采用100rpm离心2min，收集上清液，过70μm细胞筛，得到细胞滤液；

将所述细胞滤液静置5min，采用100rpm离心30s，收集上清液并加入完全培养基进行稀释混匀，得到细胞悬液；所述六孔细胞培养板的每个孔为1.5ml，所述培养箱的温度为22℃；

所述采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理，得到肝胰腺细胞，包括：

将肝胰腺从无菌海水中取出后，用添加抗生素预冷的D-PBS缓冲液再清洗消毒两次；

将所述肝胰腺剪成0.5-2mm²的块，放入含有百分比为0.25％的IV型胶原酶的培养皿中消化10min，中间吹打两次；

消化完成后，加入完全培养基，将细胞研磨过70μm细胞筛，得到过筛液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述获取皱纹盘鲍的肝胰腺细胞，包括：

选取健康的鲍鱼体，采用75％酒精对所述鲍鱼体进行消毒处理；

用灭菌的解剖工具将壳剥离后，再次用75％的酒精对鲍鱼软体部分消毒处理，用镊子和剪刀去除包裹在肝胰腺外的性腺和结缔组织后，剪下肝胰腺；

采用75％酒精对所述肝胰腺清洗消毒后，放入无菌海水中并置于转摇床消毒清洗1h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括

制备皱纹盘鲍肝胰腺细胞的完全培养基，所述培养基组分为：L-15基础培养基、胎牛血清、青链霉素混合液100×、硫酸庆大霉素、两性霉素B、NaCl、KCl、CaCl2、硫酸镁、氯化镁。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括：

对细胞及细胞活性进行鉴定；

所述对细胞及细胞活性进行鉴定，包括：

采用DAPI染色法对细胞进行鉴定；

采用台盼蓝染色法对细胞活性进行鉴定。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述采用DAPI染色法对细胞进行鉴定，包括：

在完全培养基中入200ul DAPI试剂，充分混匀后，室温染色10min；

吸弃DAPI染色液，用PBS洗涤3次，每次5分钟；

加入适量培养基，置于荧光显微镜下观察，激发波长为360-400nm；

其中，被染色的即为细胞。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述采用台盼蓝染色法对细胞活性进行鉴定，包括：

用PBS将台盼蓝稀释至质量分数为0.4％；

将完全培养基与0.4％台盼蓝溶液以9∶1的比例加入150ul台盼蓝；

置于显微镜下观察；其中，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染呈无色透明。