[发明专利]靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法

权利要求书

1.靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，线粒体靶向氧化石墨烯纳米复合物用于荧光成像引导下的协同光疗治疗耐药骨肉瘤，其特征在于，包括如下步骤：(1)、实验细胞、动物及肿瘤异种移植，将MG63/Dox细胞植于小鼠背部皮下，然后用荷瘤小鼠进行活体成像和光疗，(2)、PPG、TPP-PPG和TPP-PPG@ICG制备，(3)、表征，对TPP-PPG、ICG和TPP-PPG@ICG的光学特性采用紫外可见近红外分光光度计进行表征，(4)、单线态氧检测，用单线态氧绿色荧光探针检测单线态氧的生成，(5)、光热转换实验，用近红外光进行照射，使用红外线温度计记录温度变化，(6)、细胞摄取和细胞内定位，将MG63/Dox细胞培养孵育后，用PBS洗涤后在培养基中重悬，流式细胞仪检测样品的平均荧光强度，将MG63/Dox细胞与TPP-PPG@ICG共同培养，PBS洗涤细胞后加入线粒体荧光探针孵育,对线粒体进行标记，PBS再次洗涤细胞后用激光扫描共聚焦显微镜扫描获取图像，(7)、体外实验，将MG63/Dox细胞悬液培养加入不同浓度的ICG、TPP-PPG和PPG@ICG溶液，对非照射组PBS洗涤后再次培养，照射组使用808nm NIR照射后再次培养，检测细胞活力同时进行活细胞/死细胞双染，将MG63/Dox细胞加入PBS、TPP-PPG@ICG、ICG、TPP-PPG、PPG@ICG及TPP-PPG@ICG培养，加入双染试剂盒孵育，使用近红外荧光光谱进行观察，(8)、细胞凋亡和胞内ROS检测，MG63/Dox细胞培养NIR照射后低速离心收集细胞，在缓冲液中重新悬浮避光染色后，低速离心收集细胞，PBS洗涤并用结合缓冲液稀释后进行流式细胞分析，用DCFH-DA试剂盒检测细胞内ROS的产生，(9)、线粒体膜电位检测，用JC-1记录线粒体膜电位的变化，用激光共聚焦显微镜采集图像，(10)线粒体超氧化物检测，使用线粒体超氧化物荧光探针检测线粒体超氧化物的产生，(11)、ATP检测，使用ATP检测试剂盒绘制ATP浓度标准曲线，(12)、近红外荧光及热学成像，对MG63/Dox荷瘤裸鼠尾静脉注射TPP-PPG@ICG，采用近红外成像系统进行体外近红外成像，使用NRI进行照射时使用红外热成像相机对小鼠肿瘤组织温度变化进行实时成像，(13)、体内PDT/PTT联合治疗，将荷瘤小鼠随机分为6组，PBS非照射组(对照组)、TPP-PPG@ICG非照射组、ICG照射组、TPP-PPG照射组、PPG@ICG照射组和TPP-PPG@ICG照射组，静脉注射ICG，照射组在肿瘤部位使用808nmNIR进行照射，持续15天，收集肿瘤和主要器官，获取的内脏进行苏木精-伊红染色，并进行显微镜观察。

2.根据权利要求1所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，其特征在于，所述步骤(1)中MG63/Dox细胞混于100μL基质凝胶中进行移植，肿瘤体积达到60mm³时，进行活体成像和光疗。

3.根据权利要求1所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，其特征在于，所述步骤(5)中近红外光采用808nm近红外光。

4.根据权利要求3所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，其特征在于，所述步骤(8)中MG63/Dox细胞接种在6孔板中过夜，然后加入等效剂量的PBS(-)、TPP-PPG@ICG(-)、ICG(+)、TPP-PPG(+)、PPG@ICG(+)及TPP-PPG@ICG(+)共培养24h。

5.根据权利要求3所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，其特征在于，所述步骤(8)中DCFH-DA试剂盒检测细胞内ROS的产生，要先将MG63/Dox细胞接种在24孔板中过夜，加入等效剂量的PBS(-)、TPP-PPG@ICG(-)、ICG(+)、TPP-PPG(+)、PPG@ICG(+)及TPP-PPG@ICG(+)共培养24h。