[发明专利]基于算法的肺结节良恶性评估的甲基化检测试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种肺小结节良恶性评估的高灵敏度的甲基化检测试剂盒及其应用，属于基因检测技术领域。该试剂盒包括特异性检测人SHOX2和PTGER4基因的DNA甲基化的检测试剂，检测SHOX2和PTGER4甲基化基因的Ct值后，利用算法对肺小结节良恶性进行评估。特别的，本发明还提供了特异性捕获序列，用于提高重亚硫酸氢盐处理后通过目标DNA的回收率。结合多基因联合算法，能够显著提高甲基化检测的阳性检出率和特异性，将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，提高评估肺小结节良恶性的准确性，进一步提高早期肺癌检测的准确性。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及基因的甲基化检测技术，具体是指基于联合算法的肺小结节良恶性评估的甲基化检测试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌是我国30年来发生率增长最快的恶性肿瘤，20世纪70年代中期开展的我国第一次死因回顾调查资料表明，当时我国肺癌死亡率居癌症死因第5位，占全部癌死亡的7.43％；我国第二次死因抽样调查结果显示，20世纪90年代肺癌死亡率已居癌症死因第3位；在21世纪开展的第三次死因回顾调查则显示，肺癌已居癌症死因首位。根据2017年2月，国家癌症中心发布的中国最新癌症数据可知，肺癌的发病率、死亡率双率第一(大中小城市的肺癌死亡率都在40％～54％之间)，是第二名其它癌症双率的一倍左右，死亡率之高，位居2017年癌症之首。世界卫生组织(WHO)所属国际癌症研究机构(IARC)2018年发布的报告指出，肺癌作为中国最常见的恶性肿瘤，新发和死亡病例高达78万例和65万例。临床数据显示，I-II期肺癌患者的5年总生存率为30-49％，而III期及以后则为1-14％。然而相对于早期肺癌患者，进展期肺癌的患者临床结局和IV期的肺癌患者，总体5年生存率仅为10％左右。由此可见，早期发现并及时治疗对肺癌患者的预后及生存期具有重要的影响，然而目前的临床现实是，我国75％的肺癌患者诊断时已属晚期，5年生存率约16.1％。

目前肺癌筛查诊断方法主要依靠低剂量螺旋CT和胸部X影像资料，辅助诊断方法有纤维支气管镜、痰细胞学筛查和肿瘤标志物检测等。低剂量螺旋CT作为肺癌筛查存在一些局限性，如中心型肺癌的低检出率较低，假阳性率导致受检者焦虑和心理负担；胸部X影像不仅分辨率低，还容易遗漏心脏、膈肌等重叠处的病变，X射线可以查出中晚期癌，但表现为磨粉玻璃样结节的早期癌采用胸片筛查会全部遗漏，病位降低死亡率，因此不作为早筛工具；纤维支气管镜无法检出周围型细胞，且操作复杂，属于创伤性操作，受检者依从性差，难以大规模应用；痰细胞学检测对周围型肺癌不敏感，痰液样本质量常常不理想，影响检测灵敏度；肿瘤标志物虽已经广泛应用于临床，但目前尚未发现或者证实一种对肺癌特异性好的指标可以用于肺癌的大规模筛查。

肺癌常表现为肺部结节。肺结节为小的局灶性、类圆形、影像学表现密度增高的阴影，可单发或多发，不伴肺不张、肺门肿大和胸腔积液，基本分为良性结节和恶性结节两大类，良性结节为良性肿瘤、结核病、结节病或炎性结节等；恶性结节包括肺癌及转移性肿瘤等，肺癌的发生经历增生-不典型增生-原位癌-浸润性癌等一系列阶段，其规律是起初发展较慢，待发展到一定阶段速度迅速增加。因此，有效地对肺部结节进行鉴别诊断，快速明确其良恶性，能够早期发现肺癌患者，并通过尽早切除恶性结节等手段进行治疗，同时避免不必要的过度治疗。

研究提示人的矮小同源盒2(short stature homeobox2，SHOX2)基因和前列腺素E受体4(prostaglandin E receptor 4，PTGER4)基因的甲基化，在肺癌发生的早期即出现，目前在肺癌组织和肺癌患者血浆中均检测到SHOX2和PTGER4基因甲基化。Kneip等研究显示血浆中人的矮小同源盒2(short stature homeobox2，SHOX2)甲基化检测诊断肺癌的特异性高达90％，研究显示SHOX2和PTGER4基因甲基化检测的阳性率与组织学分型有一定的关系。小细胞肺癌的阳性率最高，达到80％～97％，其次是肺鳞癌，达到63％～91％，而腺癌的阳性率最低，只有39％～77％。Konecny等的研究鳞癌和小细胞肺癌患者标本SHOX2甲基化均为100％，腺癌为67％。