[发明专利]一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用

说明书

本发明提供了一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用，属于单克隆抗体开发技术领域，所述重组质粒载体，包括初始质粒载体和插入片段，所述初始质粒载体为哺乳动物细胞转座质粒，所述插入片段包括FRT‑LacZeo片段；所述抗体展示细胞系，通过在原始细胞中转染所述重组质粒载体获得。本发明利用转座酶把所需的基因转入基因组，基因敲入的效率更高；带有抗性基因的细胞多，能够更快的进入细胞单克隆阶段；更容易筛选到带有单个整合位点的抗体展示细胞，所述抗体展示细胞能够应用于抗体展示和筛选。

技术领域

本发明属于单克隆抗体开发技术领域，尤其涉及一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用。

背景技术

通过展示技术进行抗体开发是目前快速开发单克隆抗体的热门技术之一。噬菌体展示技术在应用过程中存在较多的限制，例如噬菌体展示技术难以展示全抗体或者Fab片段，展示能力弱；又如噬菌体展示筛选到的抗体序列密码子偏好性与人源细胞迥异，转入哺乳动物细胞表达后往往不能表达或者表达量很低，为后续的抗体制备和生产造成了挑战。近年来，采用哺乳动物细胞表面展示系统开发抗体成为发展人源抗体的重要方向。哺乳动物细胞，尤其是人源细胞的蛋白质折叠、翻译、分泌和翻译后修饰过程与人体内过程一致，因此大大加速了抗体开发的过程。

哺乳动物展示系统开发的关键是制备单个整合位点的宿主细胞。整合位点常用的是来自于Flp-In系统的FRT整合位点。目前制备这种宿主细胞是哺乳动物展示系统开发的难点，现有技术是通过携带FRT位点的质粒pFRT/lacZeo进行细胞转染，通过长时间的药物筛选获得基因组中插入FRT位点的细胞，进一步通过大量的制备单克隆，筛选合适的展示宿主细胞。然而质粒转染后自发的同源重组发生率低，加之单抗性基因插入后，细胞抗药性也差，使得总体筛选获得单点整合FRT基因的展示细胞株十分困难。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用，本发明所述的质粒载体通过将FRT-LacZeo片段克隆到哺乳动物细胞转座质粒中获得，本发明借助转座子技术，利用转座酶把所需的基因转入基因组，基因敲入的效率更高；在进行进一步的药物筛选中，带有抗性基因的细胞多，总体活力好，能够更快的进入细胞单克隆阶段；在单克隆挑选阶段由于编辑后的细胞比例高，因此更容易筛选到带有单个整合位点的抗体展示细胞。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种重组质粒载体，包括初始质粒载体和插入片段，所述初始质粒载体为哺乳动物细胞转座质粒，所述插入片段包括FRT-LacZeo片段。

优选的，所述FRT-LacZeo片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述哺乳动物细胞转座质粒为PB713B。

优选的，所述重组质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了一种抗体展示细胞系，所述抗体展示细胞系通过在原始细胞中转染所述的重组质粒载体获得。

优选的，所述原始细胞包括K562细胞。

本发明还提供了所述抗体展示细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将所述的重组质粒载体和表达转座酶的质粒共转染原始细胞获得待筛选细胞系；

2)向所述待筛选细胞系中添加嘌呤毒素进行筛选获得稳定表达细胞系；

3)将所述稳定表达细胞系单克隆化后，筛选仅整合一个重组质粒载体的单克隆细胞系获得抗体展示细胞系获得抗体展示细胞系。

优选的，所述表达转座酶的质粒为Super PB。