[发明专利]一种空间转录组测序数据的分析方法

权利要求书

1.一种空间转录组测序数据的分析方法，其特征在于，包括如下过程：

S1、样本检测建库；

S2、测序数据的生物信息分析。

2.如权利要求1所述的空间转录组数据生物信息分析方法，其特征在于，步骤S1包括如下过程：

(1)样本准备：将组织速冻后，使用OCT包埋剂对组织进行包埋，在低温环境下，使用冷冻切片技术从组织块上切取一张长、宽各10mm，10μm厚的切片分别贴附到组织优化芯片或文库制备芯片上，然后使用预冷甲醇固定切片，苏木精-伊红染色法对切片进行染色，组织染色结果通过明场显微镜记录组织形态和spot位置；

(2)组织优化：使用组织优化芯片对组织透化时间进行优化，首先，设置梯度透化时间向完成了明场成像的芯片添加组织透化液；然后在透化完成的芯片上进行荧光反转录，将成功捕获的mRNA反转录为带荧光标签的cDNA；反转录完成后，去除掉芯片上的组织；最后，使用荧光显微镜对芯片进行成像，依据荧光成像结果的亮度、弥散程度和组织透化时间选取最佳组织透化时间用于文库构建；

(3)文库制备：使用文库制备芯片进行空间转录组文库制备，将完成了明场成像的芯片按照最佳组织透化时间进行组织透化，释放组织mRNA与芯片上的捕获序列结合，逆转录合成cDNA片段并标记空间位置，PCR扩增合成cDNA二链，通过碱性环境使cDNA变性将cDNA二链释放到液体游离环境，以cDNA二链为模板进一步扩增合成大量cDNA，将cDNA酶切打断成200-300bp的片段，加上P5接头、i5样本索引、read 2、i7样本索引和P7接头构建标准测序文库；

(4)文库测序：利用Illumina测序平台的双端测序模式对建好的文库进行高通量测序，在Read 1端，包含了16bp的barcode信息和12bp的UMI信息用于确定转录本位置和表达量定量；在Read 2端，包含了cDNA片段，用于参考基因组比对确定mRNA所对应的基因。

3.如权利要求1所述的空间转录组数据生物信息分析方法，其特征在于，步骤S2包括如下过程：

(1)测序数据质控及基因表达量定量；

(2)spots聚类分群分析；

(3)亚群特征基因分析；

(4)空间特征基因分析。

4.如权利要求3所述的生物信息分析方法，其特征在于，步骤S2中的过程(1)的具体操作如下：

①数据测序的基本质控：将测序原始数据输入space ranger中，对spot位置进行比对获得覆盖在组织切片下的spot作为有效spot，结合芯片的序列号获得有效spot对应的barcode信息，基于有效barcode信息，对测序数据的reads质量、测序饱和度和有效barcode进行评估；

②参考基因组比对和基因组表达定量：将reads在space ranger中与参考基因组进行比对，对所有spot的基因数、有效reads数等参数进行统计评估，根据基因组比对结果、UMI计数和barcode序列信息，获得不同基因在不同的spot中的表达量丰度信息。

5.如权利要求3所述的生物信息分析方法，其特征在于，步骤S2中的过程(2)的具体操作如下：

①数据归一化：使用SCT ransform算法对基因表达量进行均一化处理；

②主成分分析：利用均一化的表达量进行PCA分析，减少背景噪音对聚类和降维的影响；

③spot聚类：Seurat的基于图论的聚类方法对spot进行聚类和分群；

④tSNE可视化：基于spot亚群分类结果，进一步使用tSNE非线性降维的方法将所有spot投影至二维平面中可视化。