[发明专利]一种第四代CAR-T细胞及其应用

权利要求书

1.一种第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述第四代CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、复合型IL-6和CCL19；

所述复合型IL-6和CCL19为NFAT调控型过表达。

2.根据权利要求1所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述复合型IL-6为IL-6和IL-6Rα的复合物，所述复合型IL-6包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

优选地，所述CCL19包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；

优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为Mesothelin；

优选地，所述抗原结合结构域为靶向Mesothelin的单链抗体；

优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域；

优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2的组合；

优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。

4.根据权利要求1-3任一项所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、Mesothelin抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成；

优选地，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括嵌合抗原受体编码基因、NFAT调控启动子、复合型IL-6编码基因和CCL19编码基因；

优选地，所述嵌合抗原受体编码基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

优选地，所述NFAT调控启动子包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；

优选地，所述复合型IL-6编码基因包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列；

优选地，所述CCL19编码基因包括SEQ ID NO:7所示的核酸序列。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括病毒载体；

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用权利要求5或6所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

8.一种权利要求1-4任一项所述的第四代CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求5或6所述的表达载体或权利要求7所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的第四代CAR-T细胞；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

10.权利要求1-4任一项所述的第四代CAR-T细胞、权利要求5或6所述的表达载体、权利要求7所述的重组慢病毒或权利要求9所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用；

优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。