[发明专利]CRISPR系统及其在构建GABRG2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR系统及其在构建GABRG2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于猪GABRG2基因编辑的CRISPR/cas9系统，包含序列如SEQ ID NO.2所示的Cas9高效表达载体pKG‑GE3和针对猪GABRG2基因的gRNA表达载体，该载体以序列如SEQ ID NO.3所示的pKG‑U6gRNA为载体骨架，表达序列如SEQ ID NO.35所示的gRNA。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及CRISPR系统及其在构建GABRG2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用。

背景技术

抑郁症(Depression)又称抑郁障碍(Mood disorder)，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，自卑抑郁，甚至悲观厌世，可有自杀企图或行为；甚至发生木僵；部分病例有明显的焦虑和运动性激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。每次发作持续至少2周以上、长者甚或数年，多数病例有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性。

癫痫(Epilepsy)即俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是大脑神经元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。由于异常放电的起始部位和传递方式的不同，癫痫发作的临床表现复杂多样，可表现为发作性运动、感觉、自主神经、意识及精神障碍等症状。癫痫患者经过正规的抗癫痫药物治疗，约70％的患者其发作是可以得到控制的，其中50％～60％的患者经2～5年的治疗可以痊愈，患者可以和正常人一样地工作和生活。癫痫的发病机制非常复杂，中枢神经系统兴奋与抑制间的不平衡导致，其主要与离子通道神经递质及神经胶质细胞的改变有关。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一类重要的中枢和外周神经系统的内源性神经递质,在维持大脑的兴奋-抑制平衡中起到重要作用。已有研究表明，GABA能神经元(以GABA为递质的神经细胞)活动不足与焦虑、重度抑郁(Major depressivedisorder,MDD)和失眠等疾病相关，磁共振波谱研究也表明抑郁症患者脑内、脑脊液、血浆中GABA水平显著下降,抗抑郁药物可使之显著升高。GABA有三类受体亚型，GABAA(GABA_ARs)和GABAC(GABA_CRs)是离子型受体(也称为配体-门控离子通道)，而GABAB(GABA_BRs)是代谢型受体(也称G-蛋白藕联受体)。GABA通常与GABAA和GABAB两类受体相结合，其中GABAA作为快速抑制性突触传递的主要介质，其亚基突变可引起抑郁、焦虑、癫痫等疾病。GABAA受体通常由2个α亚基、2个β亚基和1个γ或δ亚基组装形成异戊二烯，构成氯离子通道，其中γ2亚基(GABRG2)对于GABAA受体转运和突触功能具有重要的意义。γ2亚基合成后存在于内质网中，并与其他亚基寡聚化，进一步组装成五聚体受体，只有正确组装的受体才能通过内质网进入反式高尔基体和内体，最终到达细胞膜和突触，从而构成氯离子通道发挥抑制作用，而没有到达细胞膜和突触的受体亚基则没有此功能。GABRG2基因突变通过影响受体蛋白在细胞内的正确折叠和转运以及降解和聚集等过程，降低了通道功能，可引起包括重度抑郁、Dravet综合征型癫痫、LGS型癫痫等疾病。

本发明基于GABRG2基因突变开发了克隆猪核移植供体细胞系，后期通过细胞核移植动物克隆技术培育出活体猪模型，再通过活体猪表型确定抑郁症系和癫痫系，可用于进行抑郁症或癫痫症的发病机制研究，进一步为相关药物的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类相关疾病提供有力的实验手段。