[发明专利]一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用

说明书

本发明公开一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用。该专利中为标记GFP的人腺病毒在感染HEK‑293细胞后能表达绿色荧光蛋白，使感染的细胞在荧光显微镜下呈绿色。抗人腺病毒的药物活性通过以下实现，利用流式细胞术检测HEK‑293细胞在添加抗腺病毒药物和人腺病毒后，培养基上清中的腺病毒含量的变化。具体操作为，取适量的病毒上清重新加入一定量的HEK‑293细胞中，用流式细胞术测定细胞中被腺病毒感染的细胞的比率（带有绿色荧光的细胞），以此来评估添加药物对腺病毒增殖是否有明显的抑制作用。此方法，可以在体外快速、简便，低廉，有效，高通量的筛选候选药物分子是否具有抑制人腺病毒的作用。本专利将加速新型抗人腺病毒药物的研发。

技术领域

本发明涉及一种药物抑制人腺病毒增殖的高通量筛选方法及其应用，可以在体外快速、简便、有效、高通量的对药物是否具有抑制人腺病毒增殖作用进行筛选，有助于新型抗腺病毒药物的研发。

背景技术

人腺病毒是线性、双链、二十面体的DNA病毒，至今有70种人类腺病毒被确认，根据其遗传亲缘关系分为7种（A-G）。不同的腺病毒种类有特定的器官偏好性，C、E、B类病毒感染呼吸道；一些B类病毒感染尿道；A和F的感染靶器官是胃肠道；D类主要感染眼睛，这可能和不同腺病毒的受体不同有关。C（血清学1、2、5）类 主要引起幼儿轻微感染；B（血清学3、7、14、21）类和E类主要引起成年人感染。大多数腺病毒感染可能是亚临床的，但感染可以表现相对温和的上呼吸道疾病，以及更严重的细支气管炎和肺炎，以及腹泻和结膜炎。目前，没有批准的抗病毒药物用于特异的治疗腺病毒感染。虽然西多福韦（Cidofovir，C）和Brincidofovir被用于腺病毒治疗。西多福韦有严重的肾毒性。Brincidofovir (B)是西多福韦的磷脂偶联物，临床上主要用于治疗腺病毒感染引起的疾病。Brincidofovir毒副作用小，优于西多福韦，但部分病人也可能发生肠道毒性。因此，开发新的，高效的，毒副作用低的抗腺病毒药物仍是目前治疗腺病毒疾病的临床重大需求。目前，关于测定抗病毒药物对腺病毒抑制作用的试验主要包括测定病毒含量的免疫荧光定量、免疫荧光、病毒TCID₅₀滴度、病毒空斑减少分析、IC₅₀（半抑制浓度）。用以上方法进行高通量筛选抗腺病毒药物时，耗时长，工作量大，费用高。如何在体外、低廉、高效、快速、高通量的筛选出候选的具有抗腺病毒作用的化合物是抗腺病毒药物研发的关键。而建立快速、简便、有效、高通量的筛选平台对药物是否具有抑制腺病毒增殖作用进行筛选，有助于新的抗腺病毒药物的筛选，为新的抗腺病毒药物的研发提供一个有效的筛选平台。本发明利用抗人腺病毒药物Cidofovir和Brincidofovir作为阳性药物，来评价被筛选药物的效果。

发明内容

本发明的目的是建立一种测定药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选方法，以解决用现有常规方法高通量检测药物对腺病毒的抑制作用时的工作量大，耗时长，费用高的问题，有助于新的抗腺病毒药物的筛选，为新的抗腺病毒药物的研发提供一个有效的筛选平台。

具体地，本发明利用pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒构建质粒pAd-YFP，将质粒pAd-YFP转染到293FT细胞获得整合GFP的人腺病毒，具体方法参考https://media.addgene.org/data/49/60/162ad396-af64-11e0-90fe-003048dd6500.pdf。简单而言，所述方法步骤为：利用PmeI限制性内切酶将质粒pAdTrack-CMV线性化。将线性化的pAdTrack-CMV和腺病毒骨架载体pAdEasy-1质粒共同电转到大肠杆菌BJ5183细胞中。用卡那霉素进行单克隆筛选，将获得的质粒进行酶切鉴定，将鉴定正确的质粒转化到DH10B感受态中，挑取单克隆，进行抽提，获得质粒pAd-YFP。将质粒pAd-YFP用限制性内切酶PacI进行线性化，并用Lipofactamine 转染到293FT细胞中，将获得的病毒感染细胞，获得较高浓度的腺病毒，用于后续试验研究。腺病毒感染后，感染的细胞在荧光显微镜下为绿色，这些显示获得的腺病毒为重组腺病毒。