[发明专利]一种引起棉花花冠颜色变化的基因及其鉴定方法

权利要求书

1.控制棉花花冠颜色变化的基因是棉花的GST基因，该基因编码谷胱甘肽S转移酶GST。

2.控制棉花花冠颜色变化的基因的基因序列是SEQ ID NO.10。

3.用于鉴定控制棉花花冠颜色变化的基因的候选基因是SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13。

4.控制棉花花冠颜色变化的基因是谷胱甘肽S转移酶GST蛋白的基因，该基因所编码GST蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、或SEQ ID NO.8。

5.用于鉴定控制棉花花冠颜色变化的基因的候选基因所编码蛋白的氨基酸序列是SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、或SEQ ID NO.8。

6.一种基因工程体，其特征在于：该基因工程体的基因中至少含有如权利要求1所述棉花的GST基因，该基因的基因序列是SEQ ID NO.10；或该基因工程体的中至少含有编码谷胱甘肽S转移酶GST的蛋白，所编码GST蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、或SEQ ID NO.8。

7.一种控制棉花花冠颜色变化的方法，其特征在于：利用野生二倍体比克氏棉与陆地棉远缘杂交得到的红花品种HB118，与白花品种陆地棉遗传标准系TM-1杂交或得遗传群体，通过图位克隆技术得到棉花的GST基因，其编码谷胱甘肽S转移酶GST，通过调控该基因的表达，控制棉花花冠颜色的变化。

8.一种引起棉花花冠颜色变化的基因的鉴定方法，其特征在于：该方法的过程是：

(1)定位筛选除花色表现性状不同之外其他形性状均相同的同源或近源的红花系棉种和白花系棉种，选定：

红花系棉种：HB118

白花系棉种：118

针对上述两种棉花通过HPLC-MS/MS检测分析HB118和118中色素成分及含量，并用比色法检测验证；

(2)红花基因的精细定位和图位克隆：

以118为母本，HB118为父本，杂交得到F1代，F1代通过严格自交得到F2遗传群体，统计F2遗传群体总株数，以及其中的红色花瓣植株的株数、白色花瓣植株的株数，分析孟德尔遗传定律分离比，确定是否为单基因控制的显性形状；

定位红花基因的染色体区间；

在染色体区间中的候选基因中确定与植物色素相关的基因；

用于鉴定控制棉花花冠颜色变化的基因的候选基因有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、或SEQ ID NO.4；

鉴定候选基因在红花系棉种和白花系棉种的花瓣中的差异表达，分析候选基因，通过图位克隆分析基因差异，验证定位结果；

(3)定位基因特征分析：

对定位基因的编码蛋白进行分析；

关联花青素进行分析，定位基因的编码蛋白在HB118和118中对比是否影响其与花青素结合的能力；

结合定位基因的编码蛋白氨基酸序列的影响因素，对比分析在HB118和118中定位基因的编码蛋白的表达量的差异；

综合判断红色花瓣的差异因素的决定性因素；

(4)判断定位基因在HB118和118中差异表达是否由于启动子活性变化所导致：

针对定位基因在HB118和118的花瓣、花丝、根、茎、叶不同组织进行差异表达检测；

将定位基因-HB118与定位基因-118基因的启动子活性检测：将定位基因-HB118与定位基因-118基因的启动子进行克隆，将两个启动子与GUS连接后进行启动子活性检测瞬时转化烟草，对比二者启动子的启动活性，判断启动子活性差异；

对两个启动子序列进行原件分析：利用NewPLACE对两个启动子序列进行原件分析，判断二者与转录因子的因素关联性；判断两个启动子的原件是否具有转录因子结合位点，

(5)判断定位基因的表达调控机制：

对比定位基因-HB118与定位基因-118二者的启动子上的转录因子结合位点的差异，并调查所差异的转录因子的组织特异表达热图，进行对比分析；

序列分析相关的转录因子差异在HB118和118中的表达的差异性；

分析二者转录因子在棉花中的同源基因，分析同源基因在调控花青素合成通路基因的表达方式，并在在HB118和118棉种中进行转录因子ORF克隆，序列分析二者转录因子的差异性；

针对二者转录因子所调控表达的同源基因，在棉花中提取该转录因子，并进行聚类分析及序列对比，分析相关转录因子同源基因参与红花基因的基因调控的相关性；

推测红花基因的基因调控由哪一个同源基因所参与基因调控；

验证推测结果，针对二者的转录因子同源基因分别与定位基因-HB118和定位基因-118的启动子进行酵母单杂实验，分析和验证转录因子和启动子同源基因的结合性；

(6)外界生长环境因素的变化对红花表型的干扰：

试验和分析不同光照强度条件下，对定位基因-HB118与定位基因-118的表达差异；

(7)结合花青素合成通路相关基因及其他调控相关基因的表达分析相关基因在HB118和118花瓣中的表达差异；

(8)综合分析关于HB118红花近等基因系的特异基因表达的分子机制。