[发明专利]一种体外耳蜗微器官功能单元及其三维构建方法和应用

权利要求书

1.一种体外耳蜗微器官功能单元的三维构建方法，其特征是：包括以下步骤：

（1）将分离的Lgr5阳性耳蜗前体细胞三维培养进行诱导增殖成球，得到耳蜗类器官；

（2）三维共培养耳蜗类器官与螺旋神经元，在培养体系因子作用下，形成毛细胞与螺旋神经元连接的结构即为耳蜗微器官单元；

步骤（1）中，耳蜗类器官为利用三维培养技术诱导Lgr5阳性的内耳前体细胞克隆性增殖而来；

步骤（1）中，将分离的Lgr5阳性耳蜗前体细胞与含5vol%的Matrigel增殖培养基混悬形成三维培养7-8天，得到耳蜗类器官；其中，每1ml增殖培养基成分为DMEM/F-12 GlutaMAX培养基配置含有1.25mM的NAC、1X的N2、1X的B27、50ng/ml的EGF、50ng/ml的bFGF、50ng/ml的IGF、3μM的CHIR99021、10μM的Y-27632，待培养到第2天后，将10μM Y-27632换为2.5μM LPA，继续培养；

步骤（2）中，用Matrigel基质胶包裹耳蜗类器官和螺旋神经元，进行三维共培养；

步骤（2）中，三维共培养时，调整耳蜗类器官和螺旋神经元的位置，使螺旋神经元类似体内环形辐射神经纤维端指向耳蜗类器官，并且维持两者环形距离200-300μm；

步骤（2）中，三维共培养的时间为30天；

步骤（2）中，所述培养体系因子为每1ml的共培养培养基，其成分为DMEM/F-12GlutaMAX培养基配置含有1.25mM的NAC、1X的N2、1X的B27、10ng/ml的bFGF、0.5μM的A83-01、100ng/ml的Shh、1μM的RA以及5μM的LY411575，待培养到第5天后，撤掉LY411575，继续培养。

2.根据权利要求1所述的一种体外耳蜗微器官功能单元的三维构建方法构建的耳蜗微器官单元，其特征是：具有感受编码声信号功能的耳蜗类器官毛细胞与接受声信息转化的电信号的螺旋神经元组合在一起，并且具备两种细胞之间的突触连接，形成类似耳蜗的功能组织。

3.根据权利要求1所述的一种体外耳蜗微器官功能单元的三维构建方法构建的耳蜗微器官单元的应用，其特征是：在毛细胞再生相关研究、毛细胞损伤保护相关研究、内耳发育相关研究、听觉相关疾病发病机制相关研究、遗传性耳聋基因治疗载体的筛选及相关研究或听觉突触重建相关研究中的应用。