[发明专利]一种高效的酵母双杂交三框文库构建技术

说明书

本发明涉及一种高效的酵母双杂交三框文库构建技术，包括用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体，所述重组载体有三种，所述三种重组载体是在原始PGADT7载体分别插入碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3构建而成，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。还包括上述载体的构建方法及利用上述载体构建酵母双杂交三框文库的构建方法。本发明通过重组载体构建酵母双杂交三框文库，能够有效降低假阴性率，并且成本较为低廉。

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种高效的酵母双杂交三框文库构建技术。

背景技术

酵母双杂交技术在研究两个已知蛋白间相互作用以及利用酵母双杂交技术高通量筛选已知获得未知蛋白方面具有广泛的用途，且近年来取得长足发展。酵母双杂交技术的优化改进一直是为降低酵母双杂交筛选的假阳性或者假阴性的产生而设计的。而文库的质量是以上目的的达成关键。

Clontech公司研发的matplate文库，在合适的选择培养基上，将酵母猎物蛋白文库和诱饵菌株通过mating的方式共培养筛选出与已知蛋白相互作用的猎物蛋白。其文库构建的原理是利用了酿酒酵母体内本底的高效的同源重组机制。在Y187酵母菌内完成载体和双链cDNA的同源重组。是一种高效的文库构建筛选策略，但是由于酵母双杂交筛选技术是在蛋白水平上研究两个蛋白之间相互作用的。其构建的为表达文库，被构建的双链CDNA最终是需要翻译成蛋白起到筛选作用的。上述文库存在假阴性较高的问题。

因此开发一种高效的可以起修复矫正作用的三框文库技术，增加文库筛选的有效滴度，降低筛选的假阴性率是我们亟待解决的问题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种高效的酵母双杂交三框文库构建技术，通过重组载体构建酵母双杂交三框文库，能够有效降低假阴性率，并且成本较为低廉。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

本发明保护一种用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体，所述重组载体有三种，所述三种重组载体是在原始PGADT7载体分别插入碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3构建而成，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

本发明还保护上述用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体的构建方法，包括以下步骤：

步骤1)，全基因合成碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；

步骤2)，SfiI单酶切原始PGADT7载体并回收酶切载体备用；

步骤3)，将步骤1)合成的碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3连接到步骤2)得到的酶切载体中，得到三种重组载体。

在上述技术方案的基础上，本发明还能够有如下改进。

进一步，所述步骤2)中，用PCR产物回收试剂盒回收酶切载体。

本发明还保护采用上述重组载体的用于高效酵母双杂交三框文库的构建方法，包括以下步骤：

步骤a，双链cDNA制备：提取总RNA，分离出mRNA，经逆转录PCR合成单链cDNA，再通过LD-PCR以单链cDNA扩增获得双链cDNA；

步骤b，构建重组载体：在原始PGADT7载体分别插入碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3构建三种重组载体；