[发明专利]一种人源CYP2D6*10转基因小鼠模型的构建方法在审
| 申请号： | 202011499244.0 | 申请日： | 2020-12-17 |
| 公开（公告）号： | CN112626119A | 公开（公告）日： | 2021-04-09 |
| 发明（设计）人： | 陈冰冰;钱建畅;胡国新;李军伟;肖健;林丽 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;A01K67/027;C12N15/53 |
| 代理公司： | 杭州知闲专利代理事务所(特殊普通合伙) 33315 | 代理人： | 张勋斌 |
| 地址： | 325036 浙江省温州市瓯海*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 cyp2d6 10 转基因 小鼠 模型 构建 方法 | ||
1.一种构建人源化CYP2D6*10转基因小鼠模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：利用同源重组原理，在小鼠的Cyp2d22基因exon4-5之间定点敲入人的CYP2D6*10(hCYP2D6*10)的表达框，获得阳性克隆后再敲除Cyp2d基因簇，得到hCYP2D6*10基因打靶载体；进行打靶后得到Cyp2dKO阳性ES细胞，经扩增注入小鼠的囊胚，再将囊胚移入代孕小鼠体内进行繁育，获得嵌合体小鼠；
所述hCYP2D6*10的核苷酸序列为列表中的序列1；
所述hCYP2D6*10基因打靶载体的序列为列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述hCYP2D6*10基因打靶载体经EcoRI限制性内切酶消化进行验证，通过琼脂糖凝胶电泳分离，具有10478bp、8673bp、5617bp、2177bp、260bp5个条带。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，hCYP2D6*10基因打靶后获得的阳性ES细胞通过PCR进行鉴定，5’臂同源重组阳性克隆应扩增出3.6kb片段，阴性克隆应无产物；3’臂同源重组阳性克隆应扩增出6.0kb片段，阴性克隆应无产物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用Crispr/Cas9技术敲除Cyp2d基因簇，Cyp2dKO阳性克隆利用PCR进行鉴定，KO阳性克隆应扩增出2.2kb片段，阴性克隆应无产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，Crispr/Cas9技术所应用sgRNA序列为列表中的序列3和序列4。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述代孕小鼠为C57BL/6J小鼠，出生后得到F0代嵌合体小鼠，F0代小鼠进行杂交，从F1代小鼠中获得hCYP2D6*10杂合或者纯合转基因小鼠。
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