[发明专利]一种工程化神经细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种工程化神经细胞及其制备方法和应用。所述工程化神经细胞来源于工程化诱导多能干细胞，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞，所述质粒包括pTet‑O‑Ngn2‑puro、Tet‑O‑FUW‑EGFP和FUdeltaGW‑rtTA。本发明中，通过病毒载体转导快速、大规模制备工程化诱导多能干细胞，随后经抗生素诱导、筛选以及分化培养得到工程化神经细胞，最后使用β‑淀粉样蛋白诱导所述工程化神经细胞获得具有阿尔兹海默症表型的细胞，整个制备过程操作简单，周期短，且可大规模制备，为药物开发研究提供性质均一、可重复的实验材料。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种工程化神经细胞及其制备方法和应用。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)是一种以β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)沉积、神经原纤维缠结(NFTs)和老年斑(SP)形成为主要特征的神经退行性疾病。目前，AD是神经疾病领域的重要攻关对象，而理想的AD模型则是探究其发病机制与新药研发的重要基础，AD模型的构建是其病理特征的人为再现，也是抗AD药物筛选和研发的重要平台，相比于体内模型，体外模型在获取和建立上更方便快捷，其高效的操作与数据获取也非常适用于最初的高通量药物筛选。

Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经蛋白酶加工而来的一种小分子多肽，根据氨基酸序列差异可分为Aβ_1-42、Aβ_1-40和Aβ_25-35。Aβ级联假说认为，Aβ因疏水而发生异常沉积最终产生SP，引起系列下游级联反应，包括氧化应激、线粒体功能损伤、钙稳态失衡和兴奋性毒性等，进而导致神经元损伤与凋亡，加速AD的发生和发展。因此，Aβ常被用于构建AD体外模型。

现有技术常通过将诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)诱导分化为神经细胞后再使用Aβ诱导构建AD模型。如Liu(Liu X Q,Deng Y X,Dai Z,etal.Sodium tanshinone IIAsulfonate protects against Aβ_1-42-induced cellulartoxicity by modulating Aβ-degrading enzymes in HT22 cells[J].InternationalJournal of Biological Macromolecules,2020,151:47-55.)等采用20μmol/L的Aβ_1-42诱导HT22细胞24h，胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平显著升高，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低，多数细胞胞体变圆，突触变短或消失，线粒体膜电位和ATP酶活力下降。Zhong(Zhong L,Tong Y,Chuan J,et al.Protective effect ofethyl vanillin against Aβ-induced neurotoxicity in PC12 cells via thereduction of oxidative stress and apoptosis[J].ExperimentalTherapeuticMedicine,2019,17(4):2666-2674.)等采用20μmol/L的Aβ_1-42诱导PC12细胞，细胞内ROS和MDA水平显著升高，SOD、过氧化氢酶(CAT)和GSH-Px活性明显降低，凋亡相关蛋白Caspase-3与Bax/Bcl-2水平显著升高。但iPSC和神经元细胞培养及诱导难度较高，诱导过程较为复杂，周期长，且神经元细胞只能分化无法增殖，每次诱导数量有限，多次诱导难以满足均一性要求，严重影响了AD研究的重复性。

综上所述，如何提供一种标准化和精确的建立AD体外模型的方法，操作简单，周期短，制备量大，成为AD研究领域亟待解决的问题之一。

发明内容