[发明专利]一种艰难梭菌重组蛋白单克隆抗体的制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种重组蛋白，该重组蛋白由艰难梭菌膜蛋白‑谷氨酸脱氢酶（GDH）的两段优势抗原表位重复串联组成，为提高该重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体。本发明还涉及该重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，经淘选筛选得到对应GDH单链抗体scfv序列，将得到的scfv序列构建成完整鼠IgG1抗体序列表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体并分别标记辣根过氧化物酶(HRP),ELISA正交实验确定最佳单抗配对组合。

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体的说，本发明表达了一种新的重组蛋白，本发明涉及使用上述重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，筛选得到特异性单链抗体scfv序列，还涉及将得到的scfv序列构建成真核表达载体表达GDH单克隆抗体，并应用于艰难梭菌感染(CDI)的早期诊断。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile)对氧极为敏感，分离培养较困难.故命名为艰难梭菌。艰难梭菌是一种厌氧生长的革兰阳性梭状产毒芽孢杆菌，而人的肠道是一个相对无氧的环境，所以它是人类肠道中的正常菌群，不规范使用抗生素时，可导致肠道菌群失调。

艰难梭菌感染(CDI)是一种细菌毒素介导的疾病并且是医院获得性感染的主要原因。大多数CDI是肠道内微生物群系失调(正常肠道菌群的破坏) 引起的，是先前用广谱抗生素治疗的结果，因为广谱抗生素促进了艰难梭菌的繁殖。自相矛盾的是，用于治疗CDI的这些抗生素恰恰又延长了允许这种病原体引起疾病的失调，结果导致了更高比例的疾病复发。感染艰难梭菌会导致感染范围从中度腹泻和假膜性结肠炎到中毒性巨结肠、败血症和死亡的症状。

CDI最常见于伴有合并症的老年患者，感染通常在用广谱抗生素治疗以后发生。抗生素介导的有益肠道微生物群落的破坏让艰难梭菌的定居和感染成为可能。通常用于治疗CDI的抗生素(甲硝唑、万古霉素、和非达霉素) 延长了肠道生态失调，并且导致停止抗生素治疗后感染复发率达到了 13％-25％。美国每年发生超过50万例艰难梭菌的新病例，并且估计每年在欧洲发生超过40万例诊断的CDI事件。

谷氨酸脱氢酶(GDH)是艰难梭菌的一种膜蛋白，稳定性好，是检测CDI 的高敏感性、低特异性的酶。GDH位于细胞表面，所以免疫动物后能产生高滴度抗体，在对多个物种的GDH的氨基酸序列进行分析时发现，GDH具有高度保守性和低点突变率等优点。总之，GDH作为艰难梭菌的一种种属特异性蛋白，非常适合用于CDI的检测。

目前，艰难梭菌感染和疾病的有效治疗和预防措施是缺少的，所以艰难梭菌的检测对其感染的早期诊断有重要意义。艰难梭菌的检测方法有多种，主要以免疫学检测为主，因为其操作简单，灵敏快速，但是其中的过程还是有一些不足。比如在传统制备单克隆抗体方面，免疫原一般用的是天然抗原，而天然抗原的有些序列表位具有保守性，与其他物种有高度同源性，从而导致所制得的单克隆抗体特异性差，也可导致检测结果失真。用Balb/c小鼠腹水制备单克隆抗体的周期长，批间差异大。真核系统表达产物加工机制最接近体内天然形式，易保留生物活性，可以对表达产物进行适当修饰和区域分布；还可以用瞬时转染的方式快速灵活的制备单克隆抗体，使得制备周期大大缩短，且其稳定性强，批间差异小。故本发明所需单克隆抗体用真核系统表达。

发明内容

设计目的：为解决传统制备单克隆抗体的不足之处，通过设计、合成重组GDH抗原并通过建立噬菌体库和真核细胞表达来制备其单克隆抗体，比传统单克隆抗体制备大大缩短了时间，并且得到的单克隆抗体稳定性高，均一性好，大大减小了批间差异。