[发明专利]一种脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的培养液及其制备方法和脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的方法

说明书

本发明公开了一种脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的培养液及其制备方法和脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的方法，属于畜牧养殖技术领域，本发明目的是为了有效的脱除自然状态下侵染到胚胎内部的猪Ⅱ型圆环病毒。本发明培养液是由金刚烷胺、硒代蛋氨酸和PZM‑3组成，制备方法是向PZM‑3培养液中添加金刚烷胺和硒代蛋氨酸后混匀，经过过滤除菌，平衡处理。脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的方法是用上述培养液对猪胚胎进行培养。本发明可以降低囊胚内的猪Ⅱ型圆环病毒核酸的拷贝数，在不影响囊胚的发育前提下，不仅能抑制发育中的胚胎内病毒核酸复制，同时还能抑制病毒衣壳蛋白的合成。

技术领域

本发明属于畜牧养殖技术领域，具体涉及一种脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的培养液及其制备方法和脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的方法。

背景技术

猪体外受精(In vitro fertilization,IVF)和体细胞核移植(Somatic cellnuclear transfer, SCNT)技术已经得到了较广泛的应用，然而以上两种技术都需要经体外成熟(In vitro maturation,IVM)培养得到的处于减数第二次分裂的高质量MII期卵母细胞。但是用于 IVM的卵母细胞主要来源于商业屠宰场的卵巢，而被屠宰的家畜携带病原体成为重要隐患。我们的监测数据显示，猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)在屠宰场来源的卵巢中感染率达 77.5％，是屠宰场来源卵巢中的主要病原体之一。而PCV-2作为对猪繁殖产生不利影响的一重要疫病，在胚胎收到感染后会显著的影响胚胎的质量，导致胚胎死亡。但是，PCV-2 的感染在卵母细胞成熟和体外产生(In vitroproduction,IVP)胚胎中的特点和影响并不清楚。

目前在IVP胚胎中，普遍使用的清除方法是根据国际胚胎移植协会(International Embryo Transfer Society,IETS)所推荐的胰酶清洗处理方法，其主要原理是通过胰酶进行洗涤，使粘附在透明带上的病毒脱落，同时通过多次的洗涤使培养液中的病毒粒子浓度得到的稀释，进而达到清除病毒的目的。有研究证明使用该方法能去除受病毒感染的成熟卵母细胞，但是在该试验中所使用的病毒为牛病毒性腹泻病毒(BovineViral DiarrheaVirus, BVDV)，其为有囊膜包裹的RNA病毒，但PCV-2为无囊膜包裹的DNA病毒，两种病毒在结构和组成成分上存在着显著的差异，同时，该实验中的处理对象为受病毒感染的成熟卵母细胞且为人为添加病毒后所获得的，这与在自然状态下受病毒侵染的胚胎存在差异。除此之外，有研究在IEST推荐的标准程序上将胰酶替换成透明质酸酶和输卵管分泌物，同时添加了DNase-RNase，经过该方法处理后，人为感染PCV-2病毒的阳性胚胎在PCR 检测后为阴性，成功的将病毒清除，但该试验所使用的方法仅能去除粘附在透明带表面的病毒，对于已经侵染至胚胎内部的病毒无法去除。而当使用PCV-2病毒进行人为感染胚胎后，再按照IEST推荐的标准程序或者添加蛋白酶、透明质酸酶和DNase-RNase的方法均不能有效的去除胚胎中的PCV-2。因此目前为止还未建立有效的病毒清除方法，尤其是对于自然状态下已经侵染到胚胎内部的病毒。

发明内容

本发明的目的是为了有效的脱除自然状态下侵染到胚胎内部的猪Ⅱ型圆环病毒，而提供了一种脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒培养液及其制备方法以及一种脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒方法。

为解决脱除猪Ⅱ型圆环病毒不彻底的技术问题，本发明提供的脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的培养液是由金刚烷胺、硒代蛋氨酸和PZM-3组成。

进一步地限定，所述培养液以PZM-3为基准计，金刚烷胺的浓度为4μg/mL，硒代蛋氨酸的浓度为6μM。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种上述的培养的制备方法，所述制备方法是向PZM-3培养液中添加金刚烷胺和硒代蛋氨酸后混匀，经过过滤除菌，平衡处理，获得所述的脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的培养液。

进一步地限定，所述培养液培养液在气体环境为95％(体积)的空气和5％(体积)CO₂的、饱和湿度以及温度为39℃条件下平衡处理12h-16h。