[发明专利]通俗腔蚓微卫星分子标记及其多态性引物和应用

说明书

本发明公开了通俗腔蚓微卫星分子标记及其多态性引物和应用，属于生物技术检测领域。本发明利用RAD‑seq高通量测序技术从通俗腔蚓基因组DNA中筛选出12个微卫星位点，分别为Mv01、Mv02、Mv03、Mv04、Mv05、Mv06、Mv07、Mv08、Mv09、Mv10、Mv11、Mv12，其对应的核苷酸序列如SEQ ID No.1‑12所示；并根据微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13‑36所示，使用所获得引物的扩增结果具有多态性和稳定性，可适用于通俗腔蚓种群遗传多样性检测，个体鉴定以及分子辅助育种领域，为通俗腔蚓的微卫星多态性检测奠定坚实的基础。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及通俗腔蚓微卫星分子标记及其多态性引物和应用。

背景技术

通俗腔蚓(Metaphire vulgaris)隶属于环带纲(Clitellata)，后孔寡毛目(Opisthopora)，巨蚓科(Megascolecidae)，腔蚓属(Metaphire)，广泛分布于江苏、浙江等地。通俗腔蚓体内含有较高浓度的琥珀酸，可用于平喘利尿、解痉等；还含有油酸、亚油酸等多种不饱和脂肪酸，可用于防治动脉硬化，活血化瘀、防治心脑血管等疾病。中医入药，俗称“地龙”。除此之外，蚯蚓作为土壤中大型分解者，其生态地位不言而喻，有“生态工程师”的美称。

微卫星标记，亦称简单序列重复(Simple sequence repeats，SSRs)或简单序列长度多态性(Simple sequence length polymorphisms，SSLPs)是以1-6个碱基为重复单元的简单重复序列，其中2-3个碱基的重复单元占多数，因为其重复单元比小卫星序列短，所以被称为微卫星。微卫星DNA两端一般是相对保守的单拷贝序列，并且不同等位基因间的重复数存在差异。同其他遗传分子标记相比，微卫星DNA标记不仅具有极高的个体特异性、可重复性，而且由于其变异率相对较高，所以能够提供丰富的多态位点，并通过位点的多态性分析得到杂合度和纯合度等遗传信息。目前，微卫星DNA标记在群体遗传结构研究、亲缘关系鉴定、品种鉴定等方面，都已得到广泛的应用。

微卫星位点检测方法有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、毛细管电泳、荧光标记全自动基因组扫描。但由于部分微卫星DNA片段长度差异较小，无法通过琼脂糖凝胶电泳的方法分辨，目前，微卫星荧光标记全自动基因分型技术已被普遍采用，利用FAM、TAMRA和HEX，3种不同颜色的荧光染料标记微卫星DNA引物，可以将多种不同荧光标记和不同扩增片段的PCR产物在同一加样孔中电泳，并且可将待测PCR产物与DNA内在分子量标准同时上样，通过顺序凝胶电泳，并使用软件进行图像分析，精确计算出微卫星等位基因片段大小。本法具有产量高、成本低、快速简便等优点，显示了广阔的应用前景。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明所要解决的第一技术问题是提供一组通俗腔蚓微卫星分子标记；本发明所要解决的第二技术问题是提供上述通俗腔蚓微卫星分子标记的多态性引物；本发明所要解决的第三技术问题是上述通俗腔蚓微卫星分子标记和/或多态性引物在通俗腔蚓的遗传多态性、亲缘关系鉴定、品种鉴定中的应用。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明利用RAD-seq高通量测序技术从通俗腔蚓基因组DNA中筛选出12个微卫星位点，标记编号为Mv01-12。通俗腔蚓微卫星分子标记对应的核苷酸序列如SEQ ID No.1-12所示。

本发明微卫星位点引物是从Mv01-12微卫星两端的侧翼序列上设计的正向(F)、反向引物(R)。通俗腔蚓微卫星分子标记的多态性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13-36所示，其中核苷酸序列SEQ ID No.13-14用于扩增Mv01，以此类推。

通俗腔蚓微卫星分子标记和/或分子标记的多态性引物在通俗腔蚓的遗传多态性、亲缘关系鉴定、品种鉴定中的应用。