[发明专利]一种沙门菌灭活疫苗的制备方法及应用

权利要求书

1.一种沙门菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1，利用λ-Red系统制备获得鸡白痢沙门菌基因缺失突变株ΔPagC；

步骤S2，缺失株LB平板划线，挑取单菌落转接到新鲜的LB培养基中过夜培养；

步骤S3，取过夜培养的鸡白痢沙门菌ΔPagC菌液，1:100接种到50ml液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD值约0.8；

步骤S4，加入终浓度为0.4％的甲醛溶液，继续振荡培养16h，4℃、5000rpm离心10min后收集菌体，用无菌的PBS缓冲液洗涤重悬3次后获得原液；

步骤S5，多次调整原液使其稀释10倍后测OD值为1(此时原液的浓度大约在10⁹CFU/ml)；

步骤S6，将原液浓缩一倍后与佐剂进行1:1混合，然后加到2ml的灭菌匀浆管(含钢珠)中，使用组织匀浆仪中进行乳化，待乳化完全后，取100μl均匀涂布于LB固体培养基上，37℃培养16h后观察无菌落长出，此时成功制备鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗。

2.根据权利要求1所述的一种沙门菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S1中的野生型鸡白痢沙门菌CVCC1800来源为中国兽医药品监察所。

3.根据权利要求1所述的一种沙门菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S6中的佐剂类型为ISA206。

4.一种沙门菌灭活疫苗的应用，其特征在于：包括鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的免疫保护试验和鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的DIVA特性评估。

5.根据权利要求4所述的一种沙门菌灭活疫苗的应用，其特征在于：

鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的免疫保护试验；

5.1免疫原性试验：血清效价检测

将制备的CVCC1800ΔPagC疫苗株对3-4周龄ICR小鼠进行皮下多点注射，注射剂量为1x10⁸ CFU/只，每组4只，同时设立注射PBS的阴性对照组，注射剂量为每只100μl；免疫分为3次进行，每次免疫间隔为14天；首免前和每次免疫后第13天下颌静脉采血，次日分离血清进行间接ELISA试验，将每份血清样品1:400稀释后检测其血清效价；

随着免疫次数的增加，疫苗组小鼠的抗体效价逐步上升，在三免后达到高峰，与PBS对照组差异极其显著；

5.2保护效力试验

三免后第14天对小鼠进行腹腔攻毒，攻毒后每天观察存活状态，绘制存活曲线并计算免疫保护率；

5.3盲肠病理组织变化

疫苗三免后第14天，用上述三株不同血清型的沙门菌攻毒；根据小鼠的临床症状陆续将其处死，观察盲肠组织的病理变化；

盲肠病理变化：三株不同血清型沙门菌感染小鼠后，其免疫组的盲肠粘膜层细胞出现轻微坏死脱落；对应的PBS阴性对照组小鼠的盲肠粘膜层受损严重，结构无法清晰辨别。

6.根据权利要求5所述的一种沙门菌灭活疫苗的应用，其特征在于：野生型肠炎沙门菌CVCC1800和鼠伤寒沙门菌CVCC542来源为中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

7.根据权利要求4所述的一种沙门菌灭活疫苗的应用，其特征在于：

鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的DIVA特性评估；

以PagC抗原包被ELISA酶标板，评价沙门菌ΔPagC疫苗的鉴别诊断效果。抗原包被浓度为2μg/ml，血清稀释倍数为1：400。阳性血清由鸡白痢沙门菌CVCC1800野生株多次腹腔感染小鼠后分离获得。