[发明专利]一种牙周炎致病菌的分离方法

说明书

本发明涉及微生物培养技术领域，公开了一种牙周炎致病菌的分离方法，包括以下步骤：细菌的采样：采用无菌牙线棒从人体的牙缝进行取样，制得原始样本悬液；分离培养基的配制：按比例将混合蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、葡萄糖、碳酸氢钠、L‑半胱氨酸盐、可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1L，灭菌降温后，按比例加入血红素、维生素K和无菌脱纤维绵羊血，倒平板，冷却，获得分离培养基；细菌的培养：从厌氧培养箱中取出所述原始样本悬液，37℃厌氧条件下经过所述分离培养基的培养产生特征性单克隆。本发明提供的取样方法简单、快捷，不会加剧牙龈出血和感染风险，并且提供的分离培养基的特异性高，缩短原代分离牙周炎致病菌的培养周期。

技术领域

本发明涉及一种微生物培养技术领域，尤其涉及一种牙周炎致病菌的分离方法。

背景技术

牙周病是一种慢性感染性疾病，牙周组织损伤与多种口腔微生物有关。其中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是口腔常见疾病的主要致病菌之一，也是公认的牙周疾病最重要的可疑致病菌之一；普雷沃氏菌属(Prevotella spp)是引起牙周疾病的病原菌之一，主要寄生在人类口腔中，是严格厌氧革兰氏阴性菌。流行病学研究表明，在牙周病患者及牙周健康者的牙周袋、龈沟、舌面、牙龈部位均可检测到多种致病菌。

目前，牙龈卟啉单胞菌等厌氧菌相关的研究，多围绕少数几种已建立的国际标准菌株开展，如ATCC 33277、W50、ATCC 53977、W83等。然而，由于牙龈卟啉单胞菌本身的遗传多样性，标准菌株的致病性、产生的临床症状等，其代表性都十分有限，如ATCC 53977、W83感染引起的机体免疫反应，与ATCC 33277相比，具有显著不同。利用测序技术进行的研究表明，即使是同一个牙周炎患者，其口腔中的牙龈卟啉单胞菌也具有明显的遗传多样性，这些差异可能是导致牙龈卟啉单胞菌各菌株致病能力及机制不同的原因。因此，对中国人群口腔牙龈卟啉单胞菌临床菌株分离对于进一步研究其生物学特性及致病机理意义重大。国内外有关人类普雷沃氏菌属的研究较少，最近的研究多集中在宏基因组学测定分布变化以及普雷沃氏菌属与牙龈卟啉单胞菌在疾病发生中的协同作用等方面。

体外培养是研究普雷沃氏菌属与牙龈卟啉单胞菌等厌氧细菌致病性及致病机理的重要手段。目前，国内外研究中，一般采用纸尖吸附法、龈下刮治器收集法采集龈沟液，进行培养；标准菌株常采用牛脑心浸出液(Brain Heart Infusion，BHI)或胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB)琼脂培养基添加脱纤维绵羊血；接种步骤常采用梯度稀释结合涂布法，对原始获取样本悬液进行连续稀释，使用三角涂棒均匀涂布于琼脂平板上，37℃专性厌氧条件(5％H2、10％CO2、85％N2)下培养5～7乃至14天不等。待长出特征性菌落，挑取可能的目标菌株，鉴定为阳性目标菌后，进行反复划线传代直至获得纯菌株。整个分离筛选纯化周期，往往需要2～3个月时间，甚至更长。

上述分离培养方法，其中样本采集存在以下问题：1)样本采集需要借助特定的设备；(2)基本针对牙周炎患者，无法实现对没有牙周袋或牙周袋不明显的健康个体取样；(3)操作有创，易造成受试者的痛苦和不适；(4)可能加剧牙龈出血，从而加剧感染。常用的两种培养基在原代分离普雷沃氏菌属与牙龈卟啉单胞菌等厌氧细菌时，存在的问题有：营养丰富，在分离苛养细菌时缺乏针对性，非目标杂菌容易生长过盛，影响目标菌的分离。涂布法进行的梯度稀释，操作繁琐，对严格厌氧细菌的分离效果较差，不利于单个目标菌菌落的形成，延长分离筛选周期。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牙周炎致病菌的分离方法，以解决现有技术中取样受样本状态限制、取样繁琐以及培养基特异性差等问题。

本发明的目的采用如下技术方案实现：一种牙周炎致病菌的分离方法，包括以下步骤：

细菌的采样：取出无菌牙线棒，将牙线嵌入人体的牙缝间，在牙龈处往返拉动至少两次，取出牙线，将牙线的纤维线浸入至已经过厌氧预平衡处理的TSB液体培养基中，无菌枪头吹打数次，制成原始样本悬液，放入厌氧培养箱中待用；