[发明专利]一种转座因子载体及获得其无选择标记转基因后代的方法

说明书

本发明涉及一种转座因子载体及获得其无选择标记转基因后代的方法，该载体通过以下步骤构建：1)将绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(mCherry)潮霉素抗性选择标记基因(HPT)、来源于玉米的Ac转座酶基因(AcTPase)和Ds转座因子串联组装在一起，构建转座因子载体pBDL11，其中Ds因子不带有任何选择标记，并且预先在其内部设计一个AscI单酶切位点；2)构建一个在多克隆位点两侧均含有AscI酶切位点的中间载体pBDL11，以组装任意目的基因，然后将目的基因切下并克隆到Ds因子内部。本发明把基于GFP、mCherry双荧光标记的负选择技术与基于PCR的正选择技术相结合，在转基因后代依次淘汰含有T‑DNA的个体和选择含有目的基因的无选择标记个体，从而提高转基因后代的筛选效率。

技术领域

本发明涉及转基因研究领域，主要是一种转座因子载体及获得其无选择标记转基因后代的方法。

背景技术

DNA载体应用于植物遗传转化研究领域时，通常会包含一个能表现抗生素抗性或除草剂抗性的选择标记基因，在植物遗传转化过程中用于筛选转化细胞。然而，标记基因在转基因植物体内长期保留，可能会对人类健康安全和周遭环境造成潜在的危害，当植物转化完成后，需要剔除选择性标记基因。创制无选择性标记转基因植株可避免这些风险并促进转基因植物的商业化种植。因此，近年来，建立高效而可靠的无选择标记转基因技术，已成为转基因育种应用的研究热点。

基于玉米Ac/Ds转座因子的转座因子介导的转基因重整合方法，把目的基因置于Ds因子内部，通过T-DNA转化把携带目的基因的Ds因子、Ac转座酶基因以及转化选择标记等导入植物基因组。在Ac转座酶作用下，Ds从T-DNA整合位点转座到另一位点，然后通过遗传重组和遗传分离，产生无T-DNA和稳定遗传的Ds个体，从而获得无选择标记目的基因植株。转座子技术相对于其他无选择标记系统具有两个主要的优点：第一，通过Ds转座，只需要获得少数初始转化植株，就可以在分离世代通过繁殖获得目的基因独立整合的后代群体，以便筛选合适的转基因整合位点，避免转基因表达水平受“位置”效应的影响。第二，带有目的基因的转座因子，在植物基因组中稳定转座后，其插入边界清楚、转基因DNA结构变异的频率较低，有利于目的基因的稳定表达。

最初，Goldsbrough设计的T-DNA转化载体含有NptII选择标记基因、无转座功能的顺式Ac转座酶基因以及嵌合在Ds元件中的GUS报告基因。在转化番茄之后，Ds/GUS元件转座到非连锁的位点，并在转化体自交之后与NptII发生分离，从而产生了去除NptII或者Ds/GUS的转基因后代。然而，稳定的Ds插入系的鉴定常常依赖于对大量的转基因后代进行Southern blot印记杂交分析，这种方法费力且效率低。

在Gao等(2015)建立的单荧光蛋白遗传标记的Ac/Ds转座因子系统中，通过GFP荧光检测区分携带T-DNA选择标记的转基因后代和无选择标记的后代。剔除GFP荧光阳性植株，然后对阴性植株进行Ds和目的基因序列的PCR检测，筛选无选择标记的Ds植株。必须指出的是：在上述单荧光蛋白标记的Ac/Ds转座因子载体的转基因植株群体中，由于GFP基因可能被就近转座的Ds因子插入失活，或因为植物转化过程中T-DNA发生重组，一定比例的植株的GFP基因表达受到影响，因而一部分荧光检测呈阴性的分离植株仍然携带转化标记或T-DNA序列。为了对上述转座子系统进行改进，本研究构建了携带GFP绿色荧光蛋白和mCherry红色荧光蛋白的双荧光蛋白标记的Ac/Ds转座因子载体，显著提高了选择系统的稳定性，降低了上述“伪”无选择标记目的基因植株的筛选频率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种转座因子载体及获得其无选择标记转基因后代的方法，即一种产生无选择标记转基因植物的转座因子载体及其转基因后代的筛选方法。