[发明专利]一种工业大麻性状相关基因快速定位方法

权利要求书

1.一种工业大麻性状相关基因快速定位方法，其特征在于：所述方法步骤包括：根据目标性状进行品种选择，极端群体构建，特异位点扩增片段文库构建及高通量测序，标记开发，关联分析，基因注释和实时荧光定量PCR。

2.根据权利要求1所述的一种工业大麻性状相关基因快速定位方法，其特征在于：所述品种选择具体为：选择目标性状差异显著，其他性状田间表现较为一致的两个品种作为父母本。

3.根据权利要求1所述的一种工业大麻性状相关基因快速定位方法，其特征在于：所述极端群体构建具体为：根据花期选择合适时间种植两个品种，在现蕾期拔除母本品种雄株或去除雄花，获得的杂交种即为F1代，在现蕾期选择性别相同的工业大麻植株进行挂牌，取幼嫩叶片液氮速冻，-80℃冰箱保存待用，在工艺成熟期或者籽粒成熟期收获工业大麻，测量目标性状数据。

4.根据权利要求1所述的一种工业大麻性状相关基因快速定位方法，其特征在于：所述特异位点扩增片段文库构建及高通量测序具体为：根据目标性状统计结果将样本分成差异显著的两组，每组至少选择30-100株植株，提取DNA后，每个植株样本DNA等量混合构建高低两个混池，用酶切测序软件SLAF-Predict对工业大麻参考基因组进行电子酶切预测，使用内切酶对DNA混池进行酶切，对酶切片段进行回收，在3’端加A，连接Dual-index测序接头，对各个样本中同一位点处的DNA序列片段进行PCR扩增、纯化、混和样品和切胶，经SLAF文库检验合格后，扩增产物用测序系统进行测序，对测序结果用BWA软件以水稻作为对照，评估酶切方案是否有效。

5.根据权利要求1所述的一种工业大麻性状相关基因快速定位方法，其特征在于：所述标记开发具体为：对获得的reads进行聚类分析，对工业大麻各染色体上的SLAF标签的分布进行作图，用GATK软件宝对clean reads在参考基因组上的定位结果进行SNP检测。

6.根据权利要求1所述的一种工业大麻性状相关基因快速定位方法，其特征在于：所述关联分析具体为：在关联分析之前，首先对SNP位点进行过滤，过滤掉read支持度小于4的位点、具有多个基因型的位点、隐性混池基因不是来自于隐性亲本的位点及混池之间基因型一致的位点；采用SNP-index方法进行关联分析寻找混池之间基因型频率的显著差异，用Δ(SNP-index)进行统计，SNP与目标性状关联度越强，Δ(SNP-index)的数值越接近于1；计算公式如下：SNPindex(aa)＝Maa/(Maa+Paa)；SNPindex(ab)＝Mab/(Mab+Pab)；Δ(SNP-index)＝SNPindex(aa)–SNPindex(ab)；

注：Paa是指aa池来源于父本的深度，Maa是指aa池来源于母本的深度，Pab是指ab池来源于父本的深度，Mab是指ab池来源于母本的深度；

假阳性位点的消除主要利用标记在基因组上的位置，采用SNPNUM方法对ΔSNP-index进行拟合后，根据关联阈值，在阈值以上的区域选择作为性状相关候选区域，并根据计算机模拟实验计算结果。

7.根据权利要求1所述的一种工业大麻性状相关基因快速定位方法，其特征在于：所述基因注释具体为：对关联分析得到的候选区域内的编码基因进行NR、Swiss-Prot、GO、KEGG和COG的深度注释，通过注释结果快速筛选候选基因。

8.根据权利要求1所述的一种工业大麻性状相关基因快速定位方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR具体为：选择目标性状有差异的2-3个品种，提取样本RNA，逆转录，针对不同候选基因各自设计1-2对相应的引物进行引物调试，调试结果合格的用于相对定量PCR分析。