[发明专利]CRISPR/xCas9基因编辑系统在棉花中的应用

权利要求书

1.一种适用于陆地棉的基因编辑载体pHSE401-xCas9，其特征在于，所述载体pHSE401-xCas9的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述载体pHSE401-xCas9的构建方法，其特征在于，获得目的序列xCas9，随后通过同源臂重组克隆到目标载体pHSE401-Cas9上，得到载体pHSE401-xCas9。

3.根据权利要求2所述载体pHSE401-xCas9的构建方法，其特征在于，具体方法为：

（1）以pUC57-xCas9为模板，利用引物xCas-F/R进行扩增，获得xCas9扩增片段；引物xCas-F序列如SEQ ID NO.2所示，引物xCas-R序列如SEQ ID NO.3所示；

（2）对载体pHSE401-Cas9进行双酶切，酶切位点采用XbaⅠ和SacI，得到pHSE401-Cas9酶切产物；

（3）连接目的基因xCas9扩增片段和pHSE401-Cas9酶切产物，转入大肠杆菌感受态，并获得阳性克隆，即为载体pHSE401-xCas9。

4.一种基于如权利要求1所述载体pHSE401-xCas9构建编辑靶基因GFP的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用外源GFP蛋白作为sgRNA靶基因，预测GFP基因的sgRNA序列，并分析靶序列在棉花中的脱靶效率，选择高效编缉的sgRNA序列；

（2）以pCBC-DT1T2 为模板进行PCR 扩增得到PCR产物，即sgRNA靶基因表达盒；

（3）建立酶切-连接体系，将PCR产物与pHSE401-xCas9连接，转入大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆，测序，序列正确的质粒命名为pHSE401-xCas9-GFP。

5.一种如权利要求1所述载体pHSE401-xCas9在陆地棉基因组编辑中的应用。

6.一种如权利要求1所述载体pHSE401-xCas9在陆地棉遗传转化系统的碱基编辑中的应用。