[发明专利]一种SACE_1409基因被改造的糖多孢红霉菌及其应用

说明书

本发明公开了一种SACE_1409基因被改造的糖多孢红霉菌及其应用，SACE_1409基因被改造的糖多孢红霉菌的构建方法包括以下步骤：S1，以1409‑P1、1409‑P2、1409‑P3和1409‑P4为引物，糖多孢红霉菌基因组为模板，扩增SACE_1409基因的上、下游各约1.5kb的同源片段；S2，将扩增后的SACE_1409上下游片段分别连接到pUCTSR载体上，构建质粒pUCTSRΔ1409，以此质粒为模板，通过扩增获得用于基因敲除的大片段tsr‑Δ1409；S3，将tsr‑Δ1409大片段转化到糖多孢红霉菌原生质体中，同源重组后，筛选SACE_1409基因被tsr替换的基因工程菌株，即SACE_1409基因被改造的糖多孢红霉菌。本发明克服了现有技术的不足，通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_1409基因，能够大幅度提高红霉素产量。

技术领域

本发明涉及糖多孢红霉菌技术领域，具体属于糖多孢红霉菌及其应用。

背景技术

放线菌是目前大多数抗菌类药物的重要来源，其产生的次级代谢物及其衍生物在临床应用广泛。糖多孢红霉菌所产生的次级代谢物红霉素，是一种具有广谱抗菌作用的大环内酯类抗生素，对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌及梭形芽孢杆菌等病原菌,有强大抗菌作用。

红霉素结构复杂，采用化学方法低成本合成的难度较大；传统诱变获取高产菌株的策略，面临筛选复杂和传代稳定性的问题。因此，利用基因工程方法是提高红霉素产量的一个重要途径。调控因子在微生物的生长、代谢、外界信号感知与传递等方面具有重要作用，可调控次级代谢产物如抗生素的生物合成。通过对调控因子的遗传操作可有效提高抗生素产量。本发明目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得红霉素高产菌株。

目前国内外多个课题组深入研究了糖多孢红霉菌初级及次级代谢的调控基因。Chng等于2008年报道了糖多孢红霉菌中与红霉素合成相关的第一个正调控因子BldD(SACE_2077)。本实验室近几年来集中开展糖多孢红霉菌TetR家族调控因子(TetR Familytranscriptional Regulator,TFR)研究，建立了在糖多孢红霉菌中染色体快速失活技术，鉴定出SACE_0012、SACE_7040等TFR参与糖多孢红霉菌形态分化，SACE_5599、SACE_3986、SACE_7301、SACE_3446、PccD(SACE_3396)、SACE_Lrp(SACE_5388)、SACE_5754等TFR参与红霉素生物合成的调控。其中SACE_3986、SACE_7301对红霉素生物合成分别具有负向调控和正向调控的作用，对它们的改造均可提高红霉素产量，申请的专利已获授权(专利号分别为ZL201410014348.6、ZL201310082765.X)。研究过程中发现TetR家族调控因子SACE_1409是SACE_3986与SACE_7301调控网络的一个重要靶点，通过对SACE_1409进行研究，以进一步提高红霉素的产量。

发明内容

本发明的目的是提供了一种SACE_1409基因被改造的糖多孢红霉菌及其应用，提高红霉素生产的产量。

SACE_1409可以结合红霉素生物合成基因簇内所有基因的启动子区，直接负向调控红霉素生物合成，影响红霉素的产量。

为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：

一种SACE_1409基因被改造的糖多孢红霉菌，改造方法为通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中TetR家族转录调控基因SACE_1409缺失，利用抑菌试验、HPLC(HighPerformance Liquid Chromatography)检测、qRT-PCR(Real-time Quantitative PCR)以及EMSA((Electrophoretic Mobility Shift Assay)实验，证明了缺失SACE_1409基因可以提高红霉素产量，且SACE_1409直接负向调控红霉素生物的合成。