[发明专利]一种改造YH66_06385基因的重组菌株及其构建方法与产L-异亮氨酸的应用

说明书

本发明提供一种对棒杆菌中YH66_06385基因编码序列引入点突变或改进其表达的方法，所述方法可以使带有所述突变的菌株提高L‑异亮氨酸的发酵产量。所述点突变是使YH66_06385基因序列第584位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，使编码的相应氨基酸序列第195位精氨酸被谷氨酰胺所取代。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种产L-异亮氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-异亮氨酸对于人类和动物而言是必需氨基酸，主要在医药方面用作营养剂。

异亮氨酸具有2个不对称碳原子，所以在工业上用化学合成方法廉价地单独生产L型异亮氨酸比较困难。已经开发了将α-氨基丁酸和α-氧代丁酸等L-异亮氨酸生物合成的前体作为原料，通过生物转化制造L-异亮氨酸的方法。但是这些方法的原料昂贵，并不是工业上能廉价地制造L-异亮氨酸的有效方法。

使用廉价的碳源及氮源，用直接发酵法制造L-异亮氨酸的方法有多种，例如：以对于L-异亮氨酸的拮抗剂具有抗药性的棒状杆菌属、沙雷式菌属或埃希氏杆菌属的变异株作为L-异亮氨酸生产株的方法；以L-异亮氨酸生物合成的关键酶(如苏氨酸脱氨酶或其乙酰羟基酸合酶等)，通过重组DNA技术而增强的埃希氏杆菌属或棒状杆菌属的微生物作为L-异亮氨酸生产株的方法。

对发酵法生产L-氨基酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。

用于改善这些微生物的性能性质的方法包括诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-氨基酸等。

虽然已有较多方法可以提高L-异亮氨酸的生产能力，但是为了满足日益增加的需求，仍需要发展生产L-异亮氨酸的方法。

发明内容

本发明的目的是开发用于改善细菌的L-异亮氨酸生产能力的新技术，从而提供一种有效生产L-异亮氨酸的方法。

为了实现上述目的，本发明的发明人通过研究发现，对细菌中的基因YH66_06385或其同源基因，可以通过修饰该基因或改善其表达，能够改善细菌的L-异亮氨酸生产能力。基于这些发现，完成了本发明。

本发明提供了生成L-异亮氨酸的细菌，其中编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的表达改善。本发明还提供了通过使用所述微生物生产L-异亮氨酸的方法。

本发明的第一个方面提供了生成L-异亮氨酸的细菌，其具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。

所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列是基因YH66_06385或其同源基因编码的蛋白。

所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L-异亮氨酸生产能力。

在本发明中，术语“具有L-异亮氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L-异亮氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-异亮氨酸的细菌。具有L-异亮氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L-异亮氨酸的细菌。

术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。