[发明专利]一种烟酸及烟酰胺生物传感系统

说明书

本发明公开了一种烟酸及烟酰胺生物传感系统，属于基因工程技术领域。本发明将枯草芽孢杆菌转录阻遏蛋白NadR及其靶标启动子异源构建到大肠杆菌。通过对NadR进行基于易错PCR的定向进化筛选，得到响应合适浓度烟酸的NadR突变体L171F，并利用该突变体构建在所需浓度范围内高灵敏响应烟酸的生物传感系统，可使生物传感系统在0‑50mM范围内高灵敏响应烟酸浓度。进一步通过在该系统中过表达能将烟酰胺转化为烟酸的烟酰胺酶PncA，使得该系统可以间接感受烟酰胺浓度。

技术领域

本发明涉及一种烟酸及烟酰胺生物传感系统，属于基因工程技术领域。

背景技术

烟酰胺和烟酸属B族维生素，是医药、食品、饲料、化工等领域广泛需求的重要精细化学品。近些年，我国对烟酰胺、烟酸及其衍生化学品的需求呈现爆发式增长，逐步成长为烟酰胺、烟酸的生产和消费大国。传统上通过化学法生产烟酸和烟酰胺，但是由于生物酶法催化具备反应条件温和、催化效率高、环境污染小等优势，正逐步淘汰烟酰胺和烟酸的化学合成法。

腈水合酶(Nitrile hydratase，NHase，EC 4.2.1.84)和腈水解酶(Nitrilase，EC3.5.5.1)可将3-氰基吡啶(烟腈)分别一步催化为烟酰胺和烟酸，因此利用腈水合酶和腈水解酶生产烟酰胺和烟酸具有巨大的潜在经济价值。但是，热稳定性低、酶活性不高和产物耐受性差依然是限制NHase/Nitrilase进一步工业应用的瓶颈。如何获得具备高性能的天然来源酶或人工改造酶是解决这些瓶颈问题的关键。NHase/Nitrilase酶活检测缺乏高通量的检测方法，严重限制了高性能酶的挖掘和改造工作的开展。近年来，基于转录因子的生物传感系统的开发，为酶的快速、连续定向进化提供了便利，加快了新酶创制和性能改造步伐。因此，开发烟酸和烟酰胺生物传感系统对高性能腈水合酶和腈水解酶的高通量筛选具有重大意义。另外，烟酸和烟酰胺也是生物体内维生素和NAD代谢的重要中间物质。开发以烟酸和烟酰胺为中间代谢产物的代谢工程菌同样需要响应这两种物质的基因表达调控元件。

发明内容

本发明的目的是提供一种响应烟酸的生物传感系统，包括P_lacI启动子、NadR蛋白、P_nadB启动子；所述NadR蛋白的编码基因位于P_lacI启动子下游，使P_lacI启动子调控NadR蛋白的表达；所述P_lacI启动子和P_nadB启动子的转录方向相反；所述P_nadB启动子上具有可以结合NadR蛋白和烟酸的结合物的结合位点。

在一种实施方式中，所述P_nadB启动子的下游具有标记物基因。

在一种实施方式中，所述标记物基因为绿色荧光蛋白基因。

在一种实施方式中，所述标记物基因的下游还含有P₃启动子和PncA基因；所述P₃启动子调控PncA基因的表达。

在一种实施方式中，所述P_lacI启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码所述NadR蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.6所示；所述P_nadB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述P₃启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述PncA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在一种实施方式中，所述生物传感系统以pEVO-GFP为质粒骨架。

本发明的第二个目的是提供含有所述生物传感系统的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞为大肠杆菌JM109细胞。

本发明的第三个目的是提供制备所述微生物细胞的方法，包括如下步骤：