[发明专利]一种基于超微电极阵列电化学发光的单分子蛋白检测芯片及方法

说明书

本发明涉及一种基于超微电极阵列电化学发光的单分子蛋白检测芯片及方法，具体公开了所述单分子蛋白检测芯片具有ITO电极的基底和所述ITO电极上具有三维内凹的倾斜微阱阵列；倾斜微阱阵列横向方向的两端分别具有与电源正极和负极连接的电线。本发明的单分子蛋白检测芯片制备简单，电化学发光检测体系进一步放大信号，能够实现痕量蛋白的高灵敏单分子检测。

技术领域

本发明主要涉及电分析化学及微流控领域，提出一种微芯片上微珠的阵列化方法、及其匹配的超微电极阵列电化学发光方法，并据此开发一套集成化仿生微流控芯片，以实施单分子蛋白检测。该微流控芯片通过设计超微电极阵列获得快速灵敏的响应信号，其次利用电化学发光提高检测性能，具有检测灵敏度高、检测时间短、成本低的优势，尤其适用于单分子蛋白检测，具备潜在的经济价值。

背景技术

随着现代医疗领域对蛋白检测灵敏度要求的不断提高，发展先进的蛋白检测技术是提高医疗仪器诊断能力的必由之路。传统检测方法包括免疫层析，放射免疫分析，酶联免疫吸附(ELISA)、荧光、电化学、化学发光和电化学发光等，但传统技术仍存在检测灵敏度低、时间窗口滞后、检测成本高等问题，因此无法满足日益增长的临床诊断需求。

据此，相关学者提出了单分子蛋白检测思想，其是通过数字化绝对定量降低批内、批间及不同实验室间检测差异。其核心思路是当蛋白质分子及由此产生的免疫复合物与微珠的比例较小时，含有免疫复合物的微珠的百分比遵循泊松分布，则微珠携带单一或无免疫复合物。然后，将大量的微珠离散化或分隔化到反应微孔或微液滴阵列中，则每个单元中有一个或零个靶蛋白，将蛋白含量信号转换为对含靶蛋白反应单元的计数，最终实现数字化绝对定量。单分子蛋白检测关键技术在于微芯片上微珠的阵列化方法和超微电极阵列电化学发光方法，前者目的是将传统基于溶液平均化的分子信号与参照模板的比对分析，转变为高通量离散信号的绝对计数和定量，后者目的是提高检测灵敏度。目前单分子蛋白检测设备成本昂贵，其原因主要是磁珠阵列化的高复杂度，酶标荧光检测的高要求和磁场光路的配置，使得设备内部流体和光学模块制造成本过高。

微珠阵列化技术，主要是在芯片表面滴加一滴含微珠的样本溶液，在短时间内即可阵列化数万微珠，并可生成大规模微小液滴阵列，现有研究主要关注液体宏观运动，仿照猪笼草表面加工倒悬结构的微阵列并分析其动力学机制，可以钉扎后退角，并显著加快液体的前向输运，但该技术工艺复杂，且液体宏观运动学不适用于单分子蛋白检测的微观层面。

电化学发光技术，主要是当电解液两端施加一定直流电压，会在无线连接的电极阵列上产生感应电场从而形成正负两极，在阴极发生还原反应，阳极发生氧化反应从而使得三联吡啶钌/三丙胺(Ru(bpy)3²⁺/TPrA)体系发光。超微电极阵列电化学发光技术消除了对单个阵列元件进行欧姆接触的要求，具有无线、原位、易制备及高通量的独特优势，然而目前该技术需要精准对准，操作要求较高。

其中，专利CN201710347678.0一种电化学系统中，公开了一种只含有一个电极的电化学系统，电极具有电阻，电流通过与电解液接触的两侧电极时，一侧形成阴极，另一侧形成阳极。该系统主要设计一种结构简单、操作方便的单电极电化学发光系统。

其中，专利CN201910913923.9一种微流控芯片、蛋白检测方法、装置及系统中，公开了一种基于平面微流控芯片技术、双极性电极阵列技术和微流控芯片技术，利用电致化学发光检测来实现痕量蛋白的检测。所述的双极性电极阵列需与芯片上微阱阵列精确对准，从而实现溶液中芯片上捕获的固相载体可在加电条件下发光。

目前已经公开的单分子蛋白检测技术中，无超微电极阵列电化学发光相关技术，存在问题主要是：器件制备复杂，反应过程不稳定，且不方便进行有效控制，使得其检测的一致性和重复性较差。