[发明专利]一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法、试剂盒及其应用,检测IMN的方法包括以下步骤：采集受试者的生物样品进行分离，得到待测样品；所述待测样品是尿液经差速离心和超速离心得到的尿液外泌体；尿液外泌体的鉴定，采用透射电镜及粒径分析观察尿液外泌体的形态及粒径分布；检测待测样品中PLA2R的表达水平，基于免疫反应和酶促反应，检测尿液外泌体中的PLA2R。本发明检测IMN的方法无创、特异、高效、快捷地对IMN进行有效评估，可作为是否需要进行肾活检的依据，减少肾活检这一有创检查的实施率，适用于有肾活检禁忌症的患者；适用于IMN患者的病情监测及疗效评价，推动IMN的诊治进展。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法、试剂盒及其应用。

背景技术

膜性肾病(MN)是一种累及肾小球的非炎性自身免疫性疾病，是继IgA肾病之后最常见的肾小球疾病病理类型。约70％-80％的MN患者无法找到明确的病因，称为特发性MN(IMN)；20％左右的MN与其他疾病或危险因素暴露有关，称为继发性MN(SMN)。IMN是成人肾病综合征的首要病因，约占20％-37％，40％左右的IMN患者将在10年内进展为终末期肾病。

目前肾活组织病理检查依然是诊断IMN的金标准。然而，肾活检为有创性检查，有活动性出血等严重并发症。因此，急需开发新型无创诊断技术。2009年，Beck等人发现M型磷脂酶A2受体(PLA2R)是IMN中主要的足细胞抗原。随后的研究证实，血清PLA2R抗体在IMN中的阳性率为52％-86％。

在正常和非IMN病变的肾小球中，PLA2R仅在足细胞中微弱表达，而在IMN患者中，PLA2R的表达水平显著增加。多个研究发现，IMN中肾小球原位PLA2R的阳性率大于血清PLA2R抗体，部分血清PLA2R抗体阴性的患者亦可在肾组织中发现PLA2R的沉积。说明肾脏足细胞PLA2R阳性是优选的IMN标志物，启示我们寻找与肾组织PLA2R表达一致性更好的无创生物标志物和诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法、试剂盒及其应用,检测IMN的方法无创、特异、高效、快捷地对IMN进行有效评估，可作为是否需要进行肾活检的依据，减少肾活检这一有创检查的实施率，适用于有肾活检禁忌症的患者；检测IMN的方法适用于IMN患者的病情监测及疗效评价，推动IMN的诊治进展。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法，检测IMN的方法包括以下步骤：

S1：从健康对照、IMN患者和非IMN患者的晨尿中分别获得尿液外泌体；

尿液外泌体通过晨尿经多次离心后获得；

S2：尿液外泌体的鉴定

鉴定所制备的尿液外泌体是否符合外泌体的形态、粒径特征；

S3：制备相同上样量的尿液外泌体蛋白样品

S4：采用免疫印迹法检测尿液外泌体的PLA2R蛋白

S5：结果判定：以正常对照免疫印迹灰度值的最高值为截断值，超过截断值的指示为IMN。

进一步的，所述S1中获得尿液外泌体具体包括以下步骤：将受试者晨尿第一次经2000g离心20min去除脱落细胞及碎片，所获上清第二次经13500g离心30min去除微粒，所获上清经200000g超速离心2h，得到的半透明沉淀物即为尿液外泌体。

进一步的，所述S2中尿液外泌体的形态采用透射电镜观察，具体包括以下步骤：

S21：吸取5ul尿液外泌体与5ul 4％的戊二醛混合固定20min；