[发明专利]一种简便的外泌体提取方法

说明书

本发明公开了一种简便的外泌体提取方法，包括以下步骤：(1)收集外泌体细胞上清液；(2)通过离心去除上清液中的细胞碎片；(3)将去除细胞碎片的上清液转移到超滤管中，使用超滤管富集外泌体；(4)使用PBS对超滤管中富集的外泌体进行洗涤；(5)对洗涤后的外泌体进行盐析，得到相对纯化的外泌体；(6)测定纯化后外泌体的浓度。该方法利用滤过膜截流外泌体，再通过盐析析出大分子量蛋白，解决了外泌体提取困难的问题：该方法可操作性强，真正解决了外泌体提取试剂昂贵、耗时、提取设备要求高、产物纯度不高等问题。因此，使用本发明所述提取方法大大简化了外泌体的提取方法、提高了外泌体的提取质量和提取效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简便的外泌体提取方法。

背景技术

外泌体(Exosomes)是一种被大多数细胞分泌的微小膜泡；近年来，外泌体凭借其大小及双分子膜等优势在多种疾病模型中呈现出了较细胞水平更为卓越的治疗效果。随着外泌体研究增多，树突状细胞来源的外泌体的相关研究也日益增多。现有外泌体的提取方法主要有以下几种。

1.超速离心法：超离法是最常用的外泌体提取手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多，但过程费时，且回收率不稳定；此外，重复离心操作可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。

2.PEG-base沉淀法：聚乙二醇可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀提取外泌体，但是纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等。

3.超滤离心：由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不高的问题。

4.磁珠免疫法：外泌体表面有其特异性标记物，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

发明内容

为了克服上述外泌体提取方法的缺陷，本发明的目的在于提供一种简单、对技术要求不高的提取方法，运用滤网截流大分子蛋白和外泌体，加用盐析分离大分子游离蛋白质的理论，可以最大程度的提取及纯化外泌体。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种简便的外泌体提取方法，包括以下步骤：

(1)收集外泌体细胞上清液；

(2)通过离心去除上清液中的细胞碎片；

(3)将去除细胞碎片的上清液转移到超滤管中，使用超滤管富集外泌体；

(4)使用溶剂对超滤管中富集的外泌体进行洗涤；

(5)对洗涤后的外泌体进行盐析，得到纯化的外泌体；

(6)测定纯化后外泌体的浓度。

优选的，所述步骤(2)的离心条件为：于4℃下以3000g的转速离心20min。

优选的，所述步骤(3)中超滤管的离心条件为：于4℃下以3000g的转速离心30min。

优选的，所述步骤(4)使用的溶剂为PBS。

优选的，所述步骤(5)使用的盐析试剂为饱和硫酸钠。