[发明专利]一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。本发明通过在产琥珀酸放线菌中过表达谷氨酸脱羧酶和氨基酸转运载体，通过谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成γ‑氨基丁酸，再通过氨基转运载体把γ‑氨基丁酸转运到胞外，在此过程中消耗一个质子，中和酸的压力，提高产琥珀酸放线菌的耐酸能力，从而降低发酵过程pH调节剂用量和副产物乙酸的生成。

技术领域

本发明涉及一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

琥珀酸(又名丁二酸)是一种C4平台化学品，是一种天然有机酸，广泛存在于动物、植物、人与微生物中。它能广泛应用于食品行业、化工行业和医药行业中。近些年来，由于琥珀酸可以作为C4平台化合物用于合成大量化学品和生物可降解塑料，且其被美国能源部列为12种有潜质的化学品之一。

产琥珀酸放线杆菌是一株从牛的瘤胃中分离的高产琥珀酸的革兰氏阴性菌，它能天然的生产琥珀酸，且能利用广谱的碳源用于生产琥珀酸，是生产琥珀酸最有潜力的微生物之一。密西根大学筛选的产琥珀酸放线杆菌ATCC 55618最适生长和产酸的pH为6.8(US5573931，US 5521075，US 5504004等)；南京工业大学姜岷等筛选的产琥珀酸放线杆菌CGMCC NO.1716的pH生长范围为5.0-8.0，最适产酸pH 7.0(ZL 201610382379.6，ZL201410212929.0，ZL 200610085415.9等)；本实验室筛选的产琥珀酸放线杆菌CGMCC1593的pH维持6.2-7.1，可满足生长和产酸的需求(ZL 200810146688.9，ZL 201210056568.6，ZL201110209999.7等)。

虽然利用产琥珀酸放线杆菌成功地实现了琥珀酸的高产率，但在其发酵过程中，随着琥珀酸与其他副产物酸的不断累积，使培养基的pH不断降低，而产琥珀酸放线杆菌的耐酸能力较弱，在酸性条件下易死亡，且大多数发酵都是在中性条件下进行的，因此需要大量的碱来维持中性pH条件，同时存在细菌污染的可能性。此外，在下游的工业处理步骤中，必须消耗大约等量的酸来将琥珀酸重新酸化为琥珀酸，这不仅会增加整个过程的成本，而且由于排放了大量以离子为主的废水，也会对环境造成破坏。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，通过在产琥珀酸放线菌中过表达谷氨酸脱羧酶(GadB)/删除C末端11个氨基酸的GadB(GadB_△C11)和氨基酸转运载体(GadC)，通过谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸，再通过氨基转运载体把γ-氨基丁酸转运到胞外，在此过程中消耗一个质子，中和酸的压力，提高产琥珀酸放线菌的耐酸能力，从而降低发酵过程pH调节剂用量。

本发明的第一个目的是提供一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌是在产琥珀酸放线杆菌中过表达谷氨酸脱羧酶GadB和氨基酸转运载体GadC。

进一步地，所述的谷氨酸脱羧酶GadB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的氨基酸转运载体GadC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌中，所述的谷氨酸脱羧酶GadB还包括删除C末端的11个氨基酸的谷氨酸脱羧酶GadB。

进一步地，编码所述的谷氨酸脱羧酶GadB的基因或编码删除C末端的11个氨基酸的谷氨酸脱羧酶GadB的基因，与编码所述的氨基酸转运载体GadC的基因之间还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的RBS片段。

进一步地，编码所述的谷氨酸脱羧酶GadB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述的氨基酸转运载体GadC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。