[发明专利]一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量PCR方法

说明书

本发明公开了一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量PCR的方法，所述方法包括：根据旋毛虫iss195株染色体的Scfld4基因设计引物；将提取的旋毛虫基因进行倍比浓度稀释，对所述倍比浓度稀释的旋毛虫全长基因样本分别利用所述引物进行实时荧光定量PCR检测；以所述倍比浓度稀释的旋毛虫基因实时荧光定量PCR检测的CT值为纵坐标，以相对应的DNA浓度的对数为横坐标，建立标准曲线；利用实时荧光定量PCR检测待测样品，根据所述待测样品的CT值和所述标准曲线，计算所述待测样品中旋毛虫基因的相对应的浓度。本发明运用荧光染料法设计特异性引物，建立了实时荧光定量PCR的方法，具有敏感性强、稳定性好、通量高等特点。

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，具体涉及一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量PCR方法。

背景技术

旋毛虫病是一种危害非常严重的人兽共患寄生虫病，不但给畜牧业生产造成巨大的经济损失，而且对人类身体健康也构成巨大威胁。人或动物(猪、草食动物等)主要通过误食了被旋毛虫肌肉幼虫污染的肉类而发病。

目前，关于旋毛虫的诊断，国际兽医局(OIE)公认的方法为压片镜检法和消化法。目前我国也正在使用这两种方法，然而上述的两种方法在检测时存在着一定的弊端，镜检法费时费力且敏感性较低。消化法虽然在一定程度上可以提高旋毛虫的检出率，但该方法虫体检出率必须为每克肉中含有3条虫以上才能检出，且此方法在操作时极其繁琐，需消耗大量的人力和物力。从生物安全角度来看，由镜检法和消化法所造成的漏检肉品仍对人类的健康造成威胁(摄入约75条虫体即可引起人的感染)。国内外学者对猪旋毛虫检测的方法进行了大量的研究，如应用普通PCR、PCR芯片等检测旋毛虫样本，但这些方法由于其灵敏性较低、价格昂贵，不适用于大批量旋毛虫病样本的检测。

发明内容

为此，本发明提供一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量PCR方法，以解决现有技术中灵敏性较低、价格昂贵，不适用于大批量旋毛虫病样本检测的问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明提供一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量PCR的方法，所述方法包括：

根据旋毛虫iss195株染色体的Scfld4基因设计引物；

将提取的旋毛虫基因进行倍比浓度稀释，对所述倍比浓度稀释的旋毛虫全长基因样本分别利用所述引物进行实时荧光定量PCR检测；

以所述倍比浓度稀释的旋毛虫基因实时荧光定量PCR检测的CT值为纵坐标，以相对应的DNA浓度的对数为横坐标，建立标准曲线；

利用实时荧光定量PCR检测待测样品，根据所述待测样品的CT值和所述标准曲线，计算所述待测样品中旋毛虫基因相对应的浓度。

本发明的一个实施例中，所述Scfld4基因的扩增引物为：

上游引物：5’-TTCTTAGTGCTTTCTGGGTCATCTT-3’；

下游引物：5’-CGCTTTTCCACTTACCATTCTGT-3’。

本发明的一个实施例中，所述旋毛虫基因的倍比稀释浓度分别为：41.10ng/μL、8.22ng/μL、1.644ng/μL、0.3288ng/μL、0.06576ng/μL、0.013152ng/μL、0.002630ng/μL。

本发明的一个实施例中，所述旋毛虫为T1型旋毛虫。

本发明的一个实施例中，所述PCR反应体系为：1×MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix10μL；0.2μM正向引物0.4μL；0.2μM反向引物0.4μL；1×Low Rox Dye or High Rox Dye 0.2μL；DNA模板9μL；Nuclease-Free Water To 20μL。