[发明专利]靶向软骨细胞药物递送系统的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及基因工程和生物医学领域，公开了靶向软骨细胞药物递送系统的制备方法及其应用，该方法包括以下步骤：S1：构建质粒；S2：筛选稳定细胞株；S3：提取软骨亲和靶向外泌体；S4：负载外源性miRNA‑140；S5：miRNA‑140的靶向递送。本发明实现了miRNA药物的治疗潜力，高效、组织特异性的递送药物用于治疗骨性关节炎；本发明中通过对外泌体表面膜蛋白lamp2b进行基因工程改造，把软骨细胞亲和肽与其融合，使外泌体能靶向特定的软细胞，并携带miRNA药物分子，治疗各种骨关节炎。

技术领域

本发明涉及基因工程和生物医学领域，具体为靶向软骨细胞药物递送系统的制备方法及其应用。

背景技术

向各种特定类型的细胞靶向递送药物分子是精准医学中的主要面临的主要挑战。天然外泌体具备生物功能化纳米囊泡，该囊泡可通过基因工程的手段展示多种靶向蛋白或者多肽的配体并直接包装药物以行使药物靶向递送能力。

本发明设计了靶向软骨细胞药物递送系统的制备方法及其应用，用以解决细胞靶向递送药物分子治疗潜力低的弊端。

发明内容

本发明的目的在于提供靶向软骨细胞药物递送系统的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：靶向软骨细胞药物递送系统的制备方法及其应用，该方法包括以下步骤：

S1：构建质粒，利用携带软骨细胞的亲合肽(CAP)融合表达于外泌体膜蛋白(lamp2b)上作为靶向的基因工程化外泌体可靶向软骨细胞；

S2：筛选稳定细胞株，在DC细胞中表达质粒CAP-lamp2b,筛选稳定细胞株；

S3：提取软骨亲和靶向外泌体，利用无外泌体的培养基扩增稳定表达 CAP-lamp2b细胞，收集细胞上清液，进行差异超速离心分离获取外泌体，一. 设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，PCR 纯化；

二.将步骤一PCR纯化回收后的lamp2b基因克隆到表达载体pCMV-Tag 上，构建成pCMV-lamp2b质粒；

三.再将的SEQ IDNO.1核酸DNA序列插入到步骤二所构建的质粒 pCMV-lamp2b上，得到靶向肽基因改造的lamp2b重组质粒CAP-lamp2b；

四.将步骤三的靶向肽基因改造的CAP-lamp2b重组质粒转染小鼠树枝状细胞，转染48小时后，加入G418抗生素筛选稳定表达CAP-lamp2b细胞系；

五.在无外泌体增养基和条件下培养CAP-lamp2b细胞的细胞，收集培养基，高速离心法去除死细胞及细胞碎片；

S4：负载外源性miRNA-140，通过电穿孔技术使纯化的工程化外泌体负载外源性miRNA-140；

S5：miRNA-140的靶向递送，通过关节腔注射软骨细胞靶向外泌体，从而在实现miRNA-140靶向递送到关节软骨细胞里用于骨关节炎实验。

优选的，所述步骤S3中高速离心法包含以下步骤：一，提取上清液 10000g，在4度温度下离心30分钟到50分钟；二，通过0.22微米膜将上述离心30分钟到50分钟后的上清液过滤，提取上清液100000g，在4度温度下离心70分钟到100分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀，提取上清液 100000g，在4度温度下离心70分钟到100分钟，弃上清，用400ul左右PBS 重悬获得外泌体。

优选的，所述步骤S3中，DC细胞为树突状细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞。

优选的，所述步骤S3中，SEQ IDNO.1中的核酸序列如下： GACTGGAGGGTGATCATCCCCCCCAGGCCCAGCGCC。