[发明专利]一种Cblac-Mut8漆酶突变体

说明书

本申请属于酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性高的突变体Cblac‑Mut8漆酶。本发明通过设计得到一种热稳定性强的突变体Cblac‑Mut8漆酶；经酶学性质研究，该酶最适温度为60℃，最适pH=4.0。在50℃时，Cblac‑Mut8酶活半衰期达到48h以上；在60℃时，Cblac‑Mut8酶活半衰期也可达到26.6h。而且，与Cblac漆酶（WT）相比，50℃时突变体Cblac‑Mut8的催化活性（kcat/Km）比WT提高了9.5倍，对于温度的耐受性更强，催化活性更高。本发明的技术效果与现有技术相比，所得突变体Cblac‑Mut8对孔雀石绿的降解能力强于大多数已报到漆酶，是一种具有很高工业应用前景的漆酶。

技术领域

本申请属于酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性高的突变体Cblac-Mut8漆酶。

背景技术

漆酶是一类广泛存在的酶，它能氧化多种酚类和非酚类芳香底物，同时还能还原为水，具有广泛的底物特异性和生态友好性（以空气中的分子氧为最终电子受体，仅以副产品的形式释放水），被认为是一种具有广阔应用前景的生物绿色工具。漆酶有单聚体、二聚体或四聚体糖基蛋白。主要来源是真菌漆酶和细菌漆酶，真菌漆酶一般为60-70 kDa，具有严重的糖基化修饰，最适反应温度一般为30℃-60℃， pH耐受范围在 3.5-7.0之间。而细菌漆酶具有底物谱宽，不需要糖基化修饰，热稳定性好，pH耐受性范围宽、耐碱性强等显著优点而被广泛关注。

漆酶作为一种绿色生物催化剂，在处理耐污染的环境污染物和染料废水方面具有诱人的优势，由于漆酶可以催化大量酚类和非酚类化合物的氧化，同时把分子中的氧分解成水，能够加速水中有机污染物的降解和无害化。

本发明所涉及的Cblac蛋白来源发现于德国一处热泉中的 Caldicellulosiruptor bescii，该菌是一种厌氧细菌，已报道其生长最适条件为最适生长温度 70-80℃，最高可耐受90℃高温，该菌株能够降解结晶纤维素、木聚糖，以及未处理的植物生物质，包括杨树和柳枝稷等潜在的生物能源植物。发明人以隶属DUF152家族的Cblac漆酶为对象以期提供一种热稳定性高，并能有效处理有机染料的漆酶突变体。

发明内容

本申请的技术目的是提供一种热稳定性高的突变体Cblac-Mut8漆酶，从而改善野生型Cblac漆酶的热稳定性和可溶性表达。基于一个总的发明构思，本发明还包括编码该突变体漆酶的基因、该突变体的制备方法及其应用。

一种热稳定性高的突变体Cblac-Mut8漆酶，其氨基酸序列如SEQ NO.3所示。

编码突变体Cblac-Mut8漆酶的基因序列，具体如SEQ NO.4所示。

含有上述基因序列的重组表达载体或重组菌。

一种获得上述热稳定性高的突变体Cblac-Mut8漆酶的方法，具体包括以下步骤：

1）蛋白序列预测：将Cblac漆酶的氨基酸序列利用SWISS-MODEL进行结构模拟，将建模结果提交至PROSS软件进行突变位点预测，得到如SEQ NO.3所示的突变体蛋白序列；

2）重组载体构建：根据编码原则合成该蛋白的基因序列，将该基因序列与表达载体进行重组，获得重组载体；

3）蛋白表达与纯化：重组载体在细菌受态细胞中过量表达后收集、破碎，40~60℃孵育10~60 min，离心收集沉淀，用亲和层析柱纯化，即得突变体Cblac-Mut8漆酶。

优选的，Cblac漆酶的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

进一步优选的，编码Cblac漆酶的基因序列如SEQ NO.1所示。