[发明专利]能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因及其应用

说明书

本发明涉及一种能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因及其应用。该靶点基因为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸序列中任意一种或两种。本发明运用改造后的CRISPR/Cas9载体与同源比对后所选取的α醇溶蛋白19kD与22kD各基因簇上的20bp靶标分别进行连接，通过农杆菌介导的玉米幼胚转化实验获得了α醇溶蛋白基因编辑材料，通过对后代样本进行表型观察，发现一些转基因事件的籽粒有粉质不透明的胚乳,以及19kD和22kD醇溶蛋白含量的显著下降。同时也获得了α醇溶蛋白含量显著下降的自交系材料。而醇溶蛋白的下降可提升玉米籽粒中赖氨酸和色氨酸等必需氨基酸的含量，从而提高玉米的营养品质。

技术领域

本发明涉及一种能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因及其应用。

技术背景

玉米(Zea mays)是世界上产量最高的禾本科作物之一。除了作为粮食外，玉米还是禽畜重要的饲料来源，也是重要的工业原料。因此玉米对于社会的进步起到了重要的作用。随着人们生活水平的不断提高，对于所摄取食物的品质也提出了更高的要求。因而玉米的蛋白质品质是一个重要的研究性状。

醇溶蛋白是玉米籽粒中的主要储藏蛋白，占总蛋白的60％以上，然而其赖氨酸和色氨酸等必需氨基酸含量极低，导致传统的玉米籽粒中氨基酸组成不均衡。在籽粒主要农艺性状不改变的条件下，降低籽粒中醇溶蛋白的比例能够显著地提高籽粒的蛋白质品质。

玉米籽粒中醇溶蛋白由4个基因家族编码，分为α-zein(Mr 19kDa、22kDa)，β-zein(Mr 14kDa)，γ-zein(Mr 16kDa、27kDa)，δ-zein(Mr 10kDa、15kDa)。其中，α醇溶蛋白和γ醇溶蛋白的含量占比较高，分别占了醇溶蛋白的总含量的60-70％、20-25％。α醇溶蛋白是最早被描述的储藏蛋白之一。实验研究表明α醇溶蛋白是由几个大的多基因家族编码，通过利用序列同源及基于DNA的Southern blot实验得到的拷贝数，将α醇溶蛋白分为Z1A、Z1B、Z1C和Z1D四个亚家族。根据分子量的不同，其中Z1A、Z1B、Z1D属于19kD蛋白家族，而Z1C属于22kD蛋白家族。

尽管α醇溶蛋白基因家族的大小和复杂度在各个自交系中有明显的差异，但是基因序列却高度保守。在19kD基因家族内部，Z1A、Z1B、Z1D各亚家族成员之间的同源度在75％到95％之间，而19kD和22kD基因家族之间的同源度也有60％-65％。根据其同源性，利用CRISPR/Cas9技术构建靶向19kD和22kDα醇溶蛋白基因的转化载体，通过农杆菌介导的玉米幼胚转化技术来获得转基因后代，进而分析一系列生理生化表现及细胞学变化，以期获得高赖氨酸的转基因玉米果穗。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因。

本发明的目的之二在于提供含有该靶点基因的表达载体。

本发明的目的之三在于提供该表达载体的构建方法。

本发明的目的之四在于提供该基因能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因在降低玉米中α醇溶蛋白含量，提高赖氨酸含量中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因，其特征在于该靶点基因为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸序列中任意一种或两种。

上述的能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因，其特征在于该靶点基因为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸序列中任意两种。

上述的能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因，其特征在于该靶点基因为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸序列或SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸序列。