[发明专利]呼吸道类器官培养体系及博卡病毒感染模型的构建方法

权利要求书

1.一种呼吸道类器官的培养方法，其特征在于，

人呼吸道类器官培养体系包括：Advanced DMEM/F12、50% Wnt3a条件培养基、20% R-Spondin条件培养基、10% Noggin条件培养基、5 ng/ml FGF7、20 ng/ml FGF10、50 ng/mlhEGF、5 nM Heregulin beta-1、1×B27、1.25 mM的N-乙酰半胱氨酸、10 nM Leu15-GastrinI、10 mM尼克酰胺、500 nM A83-01、10 μM SB202190、10nM Y-27632、10 nM前列腺素E2、100μg/ml Primocin、100 units /ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺；其中，Wnt3a终浓度100 ng/ml，Rspondin终浓度1 μg/ml，Noggin终浓度100 ng/ml；所述人呼吸道类器官培养体系用于构建博卡病毒人呼吸道类器官感染模型；

所述呼吸道类器官的培养方法包括：组织收集和分离、细胞解离与流式细胞分选、类器官培养和制备、类器官的鉴定；

组织收集和分离：肺正常组织，切成碎片，并用冷的PBS进一步冲洗，收集活检样本，与2mmol/L EDTA的冷螯合缓冲液冰上孵育；去除EDTA缓冲液后，组织碎片剧烈振荡重悬于EDTA的冷螯合缓冲液；组织碎片自然沉降，收集上清到牛血清白蛋白包被的离心管中；分离离心沉淀，用冷螯合缓冲液洗涤，离心；其中，EDTA的冷螯合缓冲液：去离子水中含有5.6 mmol/LNa₂HPO₄，8.0 mmol/L KH₂PO₄，96.2 mmol/L NaCl，1.6 mmol/L KCl，43.4 mmol/L 蔗糖，54.9 mmol/L D-山梨醇，0.5 mmol/L DL-二硫苏糖醇；

细胞解离与流式细胞分选：使用含有2000 U/ml的脱氧核糖核酸酶的胰酶TrypLEExpress 37 ℃对分离的肺上皮组织进行解离60 min；解离的细胞通过一个20 μm的细胞滤网过滤，用PBS洗涤；活的单个上皮细胞通过前向散射、侧向散射、脉冲宽度，及碘化丙啶或7-氨基-放线菌素的阴性染色设门选出；

类器官培养和制备：将解离分选出来的类器官在所述的人呼吸道类器官培养体系中培养；上皮碎片或单细胞在冰上包被于Matrigel中，Matrigel中无生长因子、无酚红，并接种到48孔板中，500碎片或1000细胞/25 μl Matrigel/孔；Matrigel在37 ℃聚合10 min，加250 μl/孔呼吸道类器官培养基覆盖于其上；每2天更换一次培养基，类器官每周按1:5传代。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，类器官的鉴定包括全外显子测序和拷贝数分析，质控检测和类器官活力分析和类器官荧光染色技术中的一种或多种。

3.一种博卡病毒人呼吸道类器官感染模型的构建方法，其特征在于，包括：用博卡病毒阳性标本孵育权利要求1-2任一项所述方法制备的类器官，期间均匀缓和摇晃培养板；然后弃去病毒液，使用1×PBS洗涤细胞，加入含2 % FBS的所述人呼吸道类器官培养体系，继续培养。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括：选用临床博卡病毒阳性标本液2mL孵育权利要求1-2任一项所述方法制备的类器官2 h，期间每30 min均匀缓和摇晃培养板以利于病毒吸附宿主细胞；然后弃去病毒液，使用1×PBS洗涤细胞3次，加入含2 % FBS的所述呼吸道类器官培养体系，继续培养。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，还包括病毒感染鉴定，实时荧光定量PCR技术、免疫印迹技术的一种或多种。