[发明专利]用于新型冠状病毒检测的引物及恒温显色筛查试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于新型冠状病毒检测的引物及恒温显色筛查试剂盒，属于生物技术领域。本发明设计了新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因双重恒温显色扩增筛查检测内外环引物组，并建立相应的ORF1ab基因和N基因双重恒温显色扩增筛查检测方法及筛查试剂盒，可以解决目前新型冠状病毒核酸检测仅局限于应用恒温扩增芯片法和实时荧光定量RT‑PCR方法，而没有使用廉价、便捷的恒温显色即可完成筛查检测ORF1ab基因和N基因的恒温显色筛查方法及试剂盒的问题。

技术领域

本发明涉及用于新型冠状病毒检测的引物及恒温显色筛查试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

疫情防控的关键在于早发现、早隔离、早诊断、早治疗。各大医疗机构急需明确诊断对抗疫情，其中核酸检测方法和试剂在确诊工作中扮演着最重要的角色，是疫情诊断的金标准。但目前核酸检测试剂不仅短缺，而且存在着检出率不高，经常出现假阴性的问题；而且受PCR 实验环境设施的严格要求，具有检测资质的实验室数量有限。这些都在影响新型冠状病毒肺炎病人的确诊效率，成为影响疫情防控的瓶颈问题。

基于病毒基因保守序列的RT-PCR检测方法，是呼吸道病毒检测的常用方法，本次新冠病毒检测也同样适用。该方法通过对病毒RNA进行提取、逆转录、PCR扩增病毒保守序列(RdRP基因(特异性靶点)、E蛋白基因、N蛋白基因以及一个鉴定保守基因S蛋白基因区位点；可以只检测RdRP基因或者选择RdRP基因和其他多个基因确认)，扩增体系中的荧光蛋白会结合扩增出的双链DNA序列从而发出荧光，根据检测到的荧光值判断是否有病毒存在并定量。

WHO推荐的6套检测靶点病毒保守序列有ORF1a基因、ORF1ab基因(特异性靶点RdRP)、S基因、E基因、M基因、N基因。目前，中国检测ORF1ab、N、S、E基因；德国检测RdRP、E基因、N基因；中国香港检测ORF1b-nsp14、N基因；日本检测筛查冠状病毒多基因、S基因；泰国检测N基因；美国检测N基因、PdRP。目前主要还是以ORF1ab、N、 E基因作为主要的检测靶标，其中N基因蛋白是病毒核衣壳内最重要的蛋白之一，负责RNA 的复制功能，既是作为冠状病毒诊断检测工具，也是免疫学快速诊断试剂的核心原料，是“金标准”核酸检测检测的重要靶标之一。现在新型冠状病毒RT-PCR试剂盒最大的问题可以说并非产量，而是质量。从一些报道来看，经常发生病人做三四次核酸检测，甚至四五次，才知道是阳性还是阴性的现象。即便如此，可能还有很多人检测出阴性，但已经出现白肺。或者有些人核酸检测阳转阴，但其实是假阴性。这就说明，很多试剂盒在早期研发的时候，并未完成试剂的优化、质控、灵敏度、特异性测试等等，导致灵敏度不够，检测结果不稳定。目前我国针对新型冠状病毒核酸检测有恒温扩增芯片法体外诊断试剂和实时荧光定量 RT-PCR方法核酸检测试剂，尚未有ORF1ab基因和N基因的双重恒温显色检测方法及试剂盒。

现行的新型冠状病毒检测方法都存在一定的问题，影响新型冠状病毒肺炎病人的确诊，成为影响疫情防控的瓶颈问题。检测病毒抗体和血清学方法简单快速，但特异性差，灵敏度低，假阳性高，而且短期内很难获得病毒高质量特异性抗体。病毒基因组测序检测时间长，对检测机构的技术能力和仪器条件要求较高，导致病毒基因组测序技术不能推广应用，不能满足疫情实时检测的需要。PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低；基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵；实时荧光定量PCR技术灵敏度高，可靠性好，为全封闭反应，但是该技术需要价格昂贵的荧光定量PCR仪，无法在基层检测部门和防疫机构普及，并且要保证高特异性需要荧光标记探针，检测成本较高。总之，这些核酸检测技术都存在需要依赖昂贵仪器，检测成本较高，具有实验室限制性等一系列缺点；而且这些分子生物学检测对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，无法实现在基层的普及应用，无法满足疫情期间病毒快速检测的需要。

目前新型冠状病毒检测技术存在的问题主要在于：