[发明专利]一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗

说明书

一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，以hACE2基因敲除的RNA干扰干细胞取代传统新型冠状病毒疫苗的腺病毒载体。所述RNA干扰干细胞，为一种在敲除新冠病毒易感基因ACE2、转染永生化基因SV40LT和/或hTERT的基础上重组新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰基因shRNA的干细胞。这种RNA干扰干细胞具有抵抗新冠病毒感染、无限传代、抑制新冠病毒在干细胞内复制的功能，可按姓名、ABO血型或HLA分型长期预存于‑196℃干细胞库备用，不但可取同型干细胞个体化治疗COVID‑19，还可取代具有免疫源性的腺病毒载体，将新冠病毒抗体产生基因S1‑RBD插入RNA干扰干细胞DNA中，制备能产生新冠病毒中和抗体的RNA干扰干细胞载体疫苗。

技术领域

本发明涉及一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，属于生物医学领域的传染病防治技术。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已对全球公众健康构成严重威胁。SARS-CoV-2的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N 端的结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入细胞引起感染。N蛋白为RNA合成所必需，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用，同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用。

目前的新冠病毒疫苗主要以S蛋白或其RBD为靶点设计开发。在新冠病毒载体疫苗的制备中，人腺病毒5型(Ad5)是应用最广泛的病毒载体。人腺病毒含有26-45kb的双链线性DNA基因组，基因组中含有4个早期转录基因区(E1-E4)和1个晚期转录基因区，两端各有 1段约100bp的反向未端重复序列(ITR)。第一代腺病毒载体删除了E1和E3区基因，第二代腺病毒载体删除了E1-E4区基因，Ad5为第三代腺病毒载体，删除了所有病毒编码基因，仅保留5’和3’端ITR及包装信号，可容纳36kb外源基因。虽然Ad5的细胞毒性和免疫源性减弱，外源基因表达时效提高，可感染的细胞多而应用广，但易引起非特异性感染而不适用于靶向治疗，临床应用中易产生副作用。Ad5不与宿主细胞DNA整合，虽较安全但使目的基因表达不稳定，进入宿主细胞后易被网状内皮细胞吞噬而失去作用。同时由于Ad5无法复制，会使体内重组病毒越来越少，所以不适用于临床慢性疾病的长期治疗。Ad5本质为病毒，仍具有免疫源性和细胞毒性，宿主对病毒载体的免疫应答会干扰对目的抗原的免疫应答，大多数正常人已受过腺病毒感染，对病毒载体的预存免疫也会干扰疫苗的免疫效果。

目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞 (NK)，其中应用最多的是MSCs。MSCs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞因子和分泌大量的含有miRNA的外泌体、囊泡，通过影响PI3K/AKT、NF-КB等信号通路来治疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明MSCs在重症新冠肺炎治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以进一步改造的干细胞取代腺病毒载体制备新冠病毒载体疫苗的文献报道。

通常间充质干细胞在体外传代至15-30代就会出现衰老或死亡，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。这为干细胞体外培养寿命的改良和产业化扩增提供了依据。文献报道，SARS-CoV能在ACE2 转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染的293T细胞中复制。目前报道SARS-CoV-2也通过ACE2受体感染宿主细胞，所以本发明拟将干细胞中的ACE2基因敲除。