[发明专利]一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维干细胞，以SV40LT和/或hTERT基因转染的方法构建永生化羊水干细胞系，筛选永生肺干细胞系，然后将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入永生肺干细胞系DNA，制备能通过shRNA靶向干扰新冠病毒在所述肺干细胞内复制并能在体外产业化扩增的新冠病毒基因沉默永生肺干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述肺干细胞从产前诊断后剩余的胎儿细胞、胚胎间充质干细胞、成体间充质干细胞中筛选，或经干细胞诱导获得肺干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述shRNA插入永生肺干细胞包括重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒包装、慢病毒转染、肺干细胞系的筛选和鉴定。

4.根据权利要求1、3所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA克隆到慢病毒载体的多克隆位点。

5.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。

6.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：

(1)分离羊水成纤维细胞：从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维细胞，或从新生儿脐带血、脐带组织或胎盘组织中分离间充质干细胞。

(2)构建永生羊水细胞系：构建hTERT和/或SV40LT重组载体，转染羊水成纤维细胞或间充质干细胞，制备能无限传代、永久生存的永生化羊水细胞系或间充质干细胞系。

(3)筛选永生干细胞系：用流式细胞仪检测来自不同克隆细胞系的表面分子，包括阳性分子CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5和阴性分子CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。

(4)筛选永生肺干细胞系：需符合以下特征①呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状；②细胞表面标志物CD45、CD1 1a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44为阳性；③角蛋白表达呈阴性，c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin呈阳性；④vimentin、collagen III、fibronectin表达呈阳性，而pro-Surfactant protein C、von Willebrand factor及α-smooth muscle actin表达呈阴性。

(5)给永生肺干细胞系装配RNA干扰基因：优选靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-shRNA或LV3-nCoV-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或将重组质粒LV3-nCoV-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染肺干细胞系，使shRNA基因整合到肺干细胞DNA上，从而获得能干扰nCoV在肺干细胞内复制的新功能。

(6)制成一种人工装配永生化基因、新冠病毒RNA干扰基因从而获得兼具干细胞治疗功能、永生化功能、新冠病毒RNA干扰功能的肺干细胞系。