[发明专利]一种丝裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶的特异性多肽底物

说明书

本发明提供本一种丝裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶的特异性多肽底物，包括如下从N端到C端的结构排列，所述特异性磷酸化多肽底物氨基酸序列为NH2‑YACWWYGTLKRWGAKK‑COOH。发明的多肽底物具有稳定和灵敏的特点，进而能够解决体外药物筛选检测体系往往因为缺少合适底物而重复性差、灵敏度低的问题。本发明的多肽底物可适用于检测MAP4Ks激酶抑制剂的多种体外酶学实验，包括且不限于ADP‑GloTM Kinase Assay、基于液相色谱‑质谱联用(LC‑MS)技术的激酶分析实验、酶联免疫吸附测定实验(Elisa)等等，大大提高了检测的准确度和效率，具有很强的实用性。

技术领域

本发明涉及体外生物化学检测领域，具体为一种丝裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶的特异性多肽底物。

背景技术

丝裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶(MAP4Ks)是一类丝氨酸或苏氨酸激酶的家族，包括造血祖细胞激酶1(HPK1/MAP4K1)，生发中心激酶(GCK/MAP4K2)，生发中心激酶样激酶(GLK/MAP4K3)，HPK/GCK样激酶(HGK/MAP4K4)，Misshapen-如激酶1(MINK1/MAP4K6)和TRAF2和NCK相互作用激酶(TNIK/MAP4K7)，作为有效的LATS1/2激活激酶。MAP4K的过表达或缺失影响大肿瘤抑制因子1/2(LATS1/2，Wts同源物)和Yes相关蛋白(YAP)/转录共激活因子与PDZ结合基序(TAZ)的磷酸化和活性。通过作用于LATS依赖性但哺乳动物Ste20样激酶1/2(MST1/2，Hpo同源物)非依赖性方式，MAP4K通过促进其磷酸化和抑制靶基因表达来限制YAP/TAZ的活性。MAP4K是通过直接磷酸化和激活LATS1/2激酶而成为Hippo途径的组分.MAP4K2/4/6和MST1/2都属于STE20样激酶家族，并且它们的激酶结构域彼此高度同源。MAP4K4通过LATS起作用以抑制YAP和细胞增殖。

MAP4Ks可以通过磷酸化或泛素化多个细胞内多个靶蛋白以调节细胞信号转导，影响免疫反应。例如MAP4K1(HPK1)分别通过磷酸化或泛素化SLP-76蛋白、BLNK蛋白，以抑制免疫系统的T细胞受体与B细胞受体的信号转导，导致免疫系统对癌细胞的不识别。在体外生物化学研究中，模拟MAP4K蛋白激酶家族的磷酸化过程，并筛选有效抑制剂成为热门。建立一个稳定、灵敏的药物筛选筛选体系成为药筛的关键。然而体外药物筛选检测体系往往因为缺少合适底物而重复性差、灵敏度低。

发明内容

本发明目的基于上述背景技术，提供一种可以用于体外生物化学实验的被丝裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶(MAP4Ks)特异性识别并磷酸化的底物。

为达成上述目的，本发明提出如下技术方案：一种丝裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶的特异性多肽底物，包括如下从N端到C端的结构排列，所述特异性磷酸化多肽底物氨基酸序列为NH2-YACWWYGTLKRWGAKK-COOH；或者为NH2-YACWWYGSLKRWGAKK-COOH。

进一步的，在本发明中，所述特异性磷酸化多肽底物氨基酸序列的设计通过对HPK1激酶的位置扫描肽矩阵数据中获取，获取前以Y-A-X-X-X-X-X-S/T-X-X-X-X-G-A-K-K序列为基础，X为可变氨基酸残基；

对丝氨酸或苏氨酸为中心的10个氨基酸残基位点分别选取该位置上评分高的氨基酸残基，中心位置选择丝氨酸或苏氨酸，其他9个位置选择除丝氨酸、苏氨酸外评分最高的氨基酸残基。

进一步的，在本发明中，所述特异性磷酸化多肽底物氨基酸序列的设计通过对HPK1激酶的位置扫描肽矩阵数据中获取，获取前以X1-X2-X3-X4-X5-S/T-X6-X7-X8-X9序列为基础的氨基酸序列，X为可变氨基酸残基。

X1位置除半胱氨酸C外，还可以是苯丙氨酸F、色氨酸W；

X2位置除色氨酸W外，还可以是半胱氨酸C、异亮氨酸I、苯丙氨酸F、酪氨酸Y、天冬氨酸N；