[发明专利]一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法

说明书

本发明公开了一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法，本发明将木聚糖酶与铁蛋白单亚基重组为融合蛋白，在特定pH和温度下使其成为易于沉淀的纳米级聚集体，从而使重组木聚糖酶能够进行自沉淀，通过低速离心进行快速的分离纯化，该纯化方式操作简单省时，处理量大，受设备限制小，制得的重组木聚糖酶存储方便，酶活稳定，酶学性质得以提高。

技术领域

本发明属于木聚糖酶纯化技术领域，具体涉及一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法。

背景技术

木聚糖酶是一种微生物产生的酶，其作用是帮助分解植物细胞壁，利用这一特性使其广泛应用于食品加工、造纸，以及农业和保健品行业。而目前对于木聚糖酶的纯化分离而言，无论是实验室级别还是工业生产级别，要想获得纯度大于90％的目标酶，一般都要采用色谱的方法纯化。其过程烦碎，所用试剂较贵，导致制备成本大增。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法。

本发明的技术方案如下：

一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法，包括如下步骤：

(1)将依次相连的木聚糖酶的基因片段和铁蛋白的基因片段插入pET-22b(+)质粒载体中，构建形成pET-Xyl-Ferritin，其中，木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.02所示；

(2)将步骤(1)所得的pET-Xyl-Ferritin转入大肠杆菌中，制成工程菌；

(3)将步骤(2)所得的工程菌在LB培养基中活化后，于TB培养基中扩大培养，再加入IPTG诱导表达，获得培养液；

(4)将步骤(3)所得的培养液经离心后，获得第一沉淀，再加入PBS重悬洗涤，获得菌体；

(5)将步骤(4)所得的菌体进行超声破碎；

(6)将步骤(5)所得的物料于pH＝7-8且10-30℃的条件下静置10-30min；

(7)将步骤(6)所得的物料于500-2800g离心5-15min，获得第二沉淀，即成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述木聚糖酶的基因片段的序列如SEQ IDNO.03所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述铁蛋白的基因片段的序列如SEQ ID NO.04所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述木聚糖酶的基因片段的序列如SEQ IDNO.03所示，所述铁蛋白的基因片段的序列如SEQ ID NO.04所示。

进一步优选的，所述大肠杆菌为E.coil BL21(DE3)。

进一步优选的，所述步骤(2)的活化为培养至OD600＝0.6-1.0。

进一步优选的，所述步骤(2)的扩大培养的温度为37℃，200rpm摇床培养3-4h，接种量为1∶100。

进一步优选的，所述超声破碎的条件为：超声2s，停2s，如此循环80次。

进一步优选的，所述步骤(6)为：将步骤(5)所得的物料于pH＝7.5且35℃的条件下静置20min。

进一步优选的，所述步骤(7)为：将步骤(6)所得的物料于2000g离心5min，获得第二沉淀，即成。

本发明的有益效果是：本发明将木聚糖酶与铁蛋白单亚基重组为融合蛋白，在特定pH和温度下使其成为易于沉淀的纳米级聚集体，从而使重组木聚糖酶能够进行自沉淀，通过低速离心进行快速的分离纯化，该纯化方式操作简单省时，处理量大，受设备限制小，制得的重组木聚糖酶存储方便，酶活稳定，酶学性质得以提高。