[发明专利]一种2,4-二氟苄胺的制备方法

权利要求书

1.一种2,4-二氟苄胺的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：使2,4-二氟苯甲腈与腈氧化还原酶接触，并将2,4-二氟苯甲腈还原为2,4-二氟苄胺；其中所述腈氧化还原酶为NCBI登录号为WP_004867005.1的腈氧化还原酶。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，编码所述腈氧化还原酶的基因包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述还原的反应条件包括：pH为7.2～7.5，和/或，温度为25～35℃，优选30℃。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述pH用20％的碳酸钠水溶液调节；和/或，所述还原在振荡的条件下进行，优选所述振荡为200rpm。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述还原的反应体系包括助溶剂优选异丙醇，还包括(1)足量或过量还原型辅酶，例如NADPH或NADH或FADH2或FMNH2；或(2)还原型辅酶或氧化型辅酶及其再生体系，所述再生体系包括脱氢酶和氢供体；优选所述氧化型辅酶包括NAD+、NADP+或FAD或FMN，所述脱氢酶和氢供体包括醇脱氢酶和异丙醇、葡萄糖脱氢酶和葡萄糖、甲酸脱氢酶和甲酸盐中的一种。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述再生体系包括葡萄糖脱氢酶和葡萄糖；优选地，所述葡萄糖脱氢酶为Bacillus subtilis subsp.的前孢子葡萄糖1-脱氢酶；更优选地，所述葡萄糖脱氢酶包括如NCBI登录号为NP_388275.1的氨基酸序列；进一步更优选地，编码所述葡萄糖脱氢酶的DNA包括如NCBI登录号为NC_000964.3的核苷酸序列。

7.如权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述腈氧化还原酶由以下步骤制备：

(1)接种腈还原酶的种子液至含抗生素的液体培养基中；优选地，接种量为1v/v％，所述抗生素为50μg/mL终浓度的卡那霉素，和/或，所述液体培养基为LB或TB液体培养基；

(2)培养至OD₆₀₀达到0.6～1.0优选0.8，加入IPTG诱导培养12～24h优选16h后离心收集菌体；优选地，培养的温度为37℃，诱导培养的温度为25℃，IPTG的终浓度为0.1mM，和/或，离心的条件为4500rpm，20min；

(3)将菌体重悬于缓冲液中，均质破碎得到粗酶液；所述缓冲液优选为0.05M磷酸钠缓冲液，pH7.0；

较佳地，还包括步骤(4)向所述粗酶液中缓慢滴加总体积3-3.5％的10％PEI絮凝剂，搅拌5～30min优选10min后离心取上清液，优选离心的条件为4000rpm，20min；

更佳地，还包括步骤(0)接种含有腈还原酶基因的工程菌至含抗生素的液体培养基中培养，获取种子培养液；所述抗生素为50μg/mL终浓度的卡那霉素，和/或，所述液体培养基为LB或TB液体培养基；优选地，所述培养的温度为37℃。