[发明专利]一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其应用。所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)d₃的酰胺酶基因经过突变得到，野生型酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述氨基甲酸乙酯水解酶突变体由野生型酰胺酶经过R94P、I97L、S177C或G195A中的至少一个位点突变所得。发明筛选得到来自Agrobacterium tumefaciens d₃的酰胺酶，在乙醇浓度0％‑20％之间，剩余酶活高于90％，高于25％之后酶活下降迅速，该酶对低浓度乙醇表现出极好的耐受性。通过半理性改造，构建了一个21个点突变的突变体库，并从中筛选得到4个酶活有提高的突变位点(R94P、I97L、S177C、G195A)，组合突变株I97L/G195A酶活提高了5.2倍，由原来的395U/L提高到2442U/L。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其应用。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate；C₂H₅OCONH₂)，简称EC。氨基甲酸乙酯是化工生产的重要原料，具有广泛的用途，其具有麻醉神经的作用，在医疗上用作镇静及缓和的催眠药。氨基甲酸乙酯也广泛存在于传统的发酵食品泡菜、酱油、醋和酒精饮料清酒、葡萄酒、黄酒中。1943年EC的潜在致癌作用被Nettleship等人通过研究发现，1974年国际癌症研究机构(IARC)将EC划分为2B级致癌物，2007年IARC正式将EC的致癌级别由2B类提高为2A类。实验证明氨基甲酸乙酯对所有实验动物具有致癌性，对人有潜致癌性。为了解除氨基甲酸乙酯对食品安全的危害，目前主要是通过原料修改，发酵工艺优化，发酵酒中EC前体的运输调节以及添加酸性脲酶来降低EC含量。但是，由于EC有许多前体，例如尿素，瓜氨酸，精氨酸，氢氰酸，碳酸二乙酯2-4，上述方法不能完全避免EC的形成，且对已经形成的EC没有降解作用，因此使用氨基甲酸乙酯水解酶是降解EC的最直接，最有效的方法。

氨基甲酸乙酯水解酶(EC 3.5.1.75)能将EC催化为乙醇，二氧化碳和氨(图1)，是降解EC最直接有效的办法。目前筛选得到的氨基甲酸乙酯水解酶对乙醇的耐受性差，对酸的耐受性差，对EC的亲和力低。其中现筛选得到的耐乙醇能力高的菌株分别是Micrococcussp.在20％的乙醇浓度下，保留82％酶活(Mohapatra,B.R.；Bapuji,M.,Characterizationof urethanase from Micrococcus species associated with the marine sponge(Spirastrella species).Lett.Appl.Microbiol.1997,25(6),393-396.)和Candidaparapsilosis在20％的乙醇浓度下，保留73％酶活(Masaki,K.；Mizukure,T.；Kakizono,D.；Fujihara,K.；Fujii,T.；Mukai,N.,New urethanase from the yeast Candidaparapsilosis.Journal of bioscience and bioengineering 2020.)。由于氨基甲酸乙酯水解酶主要用于发酵酒中，但是传统的发酵酒酒精浓度在20％左右，呈酸性；因此目前筛选得到的氨基甲酸乙酯水解酶适用性不高。

发明内容

针对现发现的氨基甲酸乙酯水解酶存在的问题，本发明的目的在于筛选得到一株耐乙醇且具有高活力的氨基甲酸乙酯水解酶，并且对其催化活性进行改造。