[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3及其应用

说明书

本发明公开了一种β‑葡萄糖苷酶Ttbgl3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其来源于耐热毛栓菌(Trametes trogii)S0301，将本发明β‑葡萄糖苷酶Ttbgl3应用在制备稀有苷元及单糖苷化合物中，实验结果显示β‑葡萄糖苷酶Ttbgl3具有水解多种糖苷的能力，同时具有β‑葡萄糖苷键和β‑葡萄糖醛酸苷键的水解活性，对天麻素、七叶苷、大豆苷和黄芩苷的具有较强的转化能力；本发明β‑葡萄糖苷酶Ttbgl3制备简单，具有市场推广应用的价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3基因的克隆、原核表达、纯化和对苷类化合物的转化。

背景技术

耐热毛栓菌等白腐菌在进化过程中获得了分解难降解木质纤维素的特定酶群，CAZy数据库中有包括糖苷水解酶(GH)在内的不同类型的碳水化合物降解酶。糖苷水解酶(GH)有众多的家族参与了木质纤维素的降解。研究表明，丝状真菌在木质纤维素响应过程中，分布在GH1和GH3家族里的β-葡萄糖苷酶基因表达量显著上调，丝状真菌能合成和分泌β-葡萄糖苷酶等胞外酶来同时和选择性降解木质纤维素。β-葡萄糖苷酶可催化在醛糖或葡萄糖的半缩醛-OH基团与另一种非糖化合物(例如氨基醇、芳基醇或伯、仲、叔醇)的-OH基团之间形成的糖苷键的水解；这种水解作用导致的糖苷键的断裂在各种基本生物过程中的重要作用，并引起了人们的极大兴趣；如工业中异黄酮苷的水解，将无效或低效的大豆异黄酮苷转变为有效的大豆异黄酮苷元，增强其生物活性。β-葡萄糖苷酶在食品生物加工、制药和动物饲料的处理方面也有广泛的应用。

发明内容

本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，该酶来源于耐热毛栓菌(Trametes trogii)S0301，本发明β-葡萄糖苷酶Ttbgl3同时具有β-葡萄糖苷键和β-葡萄糖醛酸苷键的水解活性，其在pH 5-10、45-55℃下具有较好的催化活性，其还具有较好的金属离子耐受性，Fe³⁺可以使Ttbgl3的活性提高到119.6％；本发明β-葡萄糖苷酶Ttbgl3对天麻素、七叶苷、大豆苷、黄芩苷等化合物具有较强的转化能力。

Ttbgl3全长cDNA为2547bp，编码849个氨基酸多肽，预测蛋白质大小为97kDa；利用NCBI数据库，将Ttbgl3氨基酸序列通过BLAST在线比对；Ttbgl3与来源于Polyporusarcularius的β-葡萄糖苷酶(Pabgl3，ID:TFK93148.1)最接近，同源性为81.74％；另外，来源于Trametes versicolor的β-葡萄糖苷酶，同源性为80.26％(Tvbgl3,ID:XP_008036945.1)；来源于Trametes coccinea的β-葡萄糖苷酶，同源性为79.34％(Tcbgl3,ID:OSD02721.1)；来源于Gelatoporia subvermispora的β-葡萄糖苷酶，同源性为74.30％(Gsbgl3,ID:EMD34486.1)

本发明将β-葡萄糖苷酶Ttbgl3基因和酶切后的pET-28b质粒连接得到含有β-葡萄糖苷酶Ttbgl3基因的重组质粒；将重组质粒转化表达宿主菌Roseeta(DE3)，采用IPTG诱导培养，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni-NTA预装重力柱柱纯化即得β-葡萄糖苷酶Ttbgl3；将β-葡萄糖苷酶Ttbgl3应用在制备稀有苷元及单糖苷化合物中，实验结果显示β-葡萄糖苷酶Ttbgl3具有水解多种糖苷的能力，对天麻素、七叶苷、大豆苷和黄芩苷的具有较强的转化能力；通过同源建模和分子对接，推测β-葡萄糖苷酶Ttbgl3中His85和Lys467两个残基可能为含有β-葡萄糖苷键的底物的酶结合位点，Glu377和Thr424可能为含有β-葡萄糖醛酸苷键的底物的酶结合位点本发明β-葡萄糖苷酶Ttbgl3制备简单，具有市场推广应用的价值。

附图说明

图1为实施例1本发明所述Ttbgl3基因特异性的琼脂糖凝胶图；