[发明专利]一种鸡病原细菌菌影及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种鸡伤寒沙门菌菌影及其制备方法和应用，属于鸡疫苗技术领域。所述制备方法首先制备具有E基因和SN基因的载体，将载体转化进鸡伤寒沙门菌asd缺失株感受态细胞制备得到所述鸡伤寒沙门菌菌影。进一步，利用所述鸡伤寒沙门菌菌影可以制备菌影疫苗。本发明制备的菌影疫苗，比灭活疫苗的保护效率更好，产生的菌影疫苗所携带的活细菌不会对鸡的健康造成影响，可以对鸡伤寒沙门菌的侵袭产生很好的免疫保护效果。该方法技术可以应用到其它细菌上，产生无活细菌的菌影，用于疫苗或其它用途。

技术领域

本发明属于鸡疫苗技术领域，具体地涉及一种鸡病原细菌菌影及其制备方法和应用。

背景技术

禽伤寒(Fowl Typhoid，FT)是由鸡伤寒沙门菌(Salmonella gullinarum，SG)引起的一种败血性传染病，各个年龄阶段的禽类均易感，死亡率可达10％-50％。由于国内养殖业饲养管理水平较差，不能有效控制鸡伤寒沙门菌在畜禽之间的传播，给养殖业造成了巨大的经济损失。生产上比较常见的是鸡伤寒沙门菌减毒活疫苗，但是减毒活疫苗安全性较低，可能会对环境造成污染。因此研发一种具有高免疫原性的安全疫苗具有十分重要的意义。

菌影是指缺少核酸、细胞质和胞质内容物的死菌菌体，它是通过生理生化等方法裂解细菌，在压强作用下使细菌内容物流出，形成的细菌空壳。与传统疫苗相比，菌影完整保留了细菌表面的抗原结构，具有很高的安全性和免疫效应，同时还具有佐剂的性质，且能够载入外源抗原、DNA疫苗、药物等物质，制备方法简单快捷，因此是一种十分优秀的灭活疫苗候选物。

发明内容

本发明的目的是提取一种鸡病原细菌菌影并进一步利用其制备疫苗。为此，采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种具备双裂解功能的ES基因，具有SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列序列。所述ES基因是将E基因和SN基因整合而来。

本发明第二方面提供(1)E基因和SN基因或(2)本发明第一方面所述的ES基因在制备具有双裂解功能的载体中的应用。

本发明第三方面提供一种具有双裂解功能的载体，包括(1)E基因和SN基因或(2)本发明第一方面所述的ES基因。

在本发明中，所述E基因和SN基因分别具有SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述E基因利用E-1F和E-1R引物从pET28α-E质粒进行PCR扩增并克隆得到。其中，E-1F和E-1R引物分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述SN基因利用SN-1F和SN-1R引物从MW2全基因组进行PCR扩增并克隆得到。其中，SN-1F和SN-1R引物分别具有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述EN基因是利用E-2F和SN-1R为上下游引物进行融合PCR扩增得到。其中，E-2F引物具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述载体是分别将所述ES基因和载体双酶切后进行连接得到的。

本发明第四方面提供本发明第三方面所述的载体在制备用于构建鸡病原细菌菌影的试剂盒中的应用。

本发明第五方面提供一种用于构建鸡病原细菌菌影的试剂盒，包括本发明第三方面所述的载体。

在本发明中，所述载体为pBAD-hisA载体。

本发明第六方面提供一种构建鸡病原细菌菌影的方法，包括利用本发明第三方面所述的载体转化鸡病原细菌asd缺失株的步骤。