[发明专利]玉米赤霉烯酮浓度及其降解酶酶活力的测定方法以及玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法

说明书

本发明涉及生物工程领域，公开了玉米赤霉烯酮浓度及其降解酶酶活力的测定方法以及玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法。本发明中采用荧光法直接、准确地测定玉米赤霉烯酮的浓度，进而用于测定玉米赤霉烯酮降解酶的活力，进而用于玉米赤霉烯酮降解菌的筛选。在本发明优选的条件下，能够实现高通量测定和筛选，提高检测和筛选的效率，缩短研发周期，降低研发成本。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，公开了一种玉米赤霉烯酮浓度的测定方法，一种玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法以及一种玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，简称ZEN)，又称F-2毒素，最初从有赤霉病的玉米中分离得到，主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，在食品及饲料加工过程中均不易被破坏，是全球污染范围最广的镰刀菌毒素之一。玉米赤霉烯酮可通过污染谷类等农作物，进入人或动物体内，危害人和动物的健康，造成巨大经济损失。同时，ZEN本身具有分布广、耐高温、毒性大、残留时间长等问题，已经引起了全世界的关注。目前大部分国家对粮油及饲料中的ZEN含量都作了严格的规定，例如，澳大利亚规定谷物中ZEN的含量不能超过50ng/g；意大利规定谷物和谷类产品当中ZEN的含量不能超过100ng/g；法国规定植物油和谷类当中ZEN含量须低于200ng/g。根据我国国家限量标准，谷物及其制品中ZEN含量应低于60μg/kg。

玉米赤霉烯酮等真菌毒素检测方法目前主要以快速、半定量的胶体金试纸条、酶联免疫试剂盒法，以及精确度更高的免疫亲和柱-高效液相色谱法、液质联用法为主，其中前者操作便捷且检测成本较低，但无法实现真菌毒素的精准定量检测，而后者虽然可以对真菌毒素进行精确定量，但因为其操作复杂、成本较高的特点，无法应用于高通量检测及一线生产单位的检测工作。因此，开发一种快速、操作简单的低成本的高通量检测方法，对于下游菌株筛选及真菌毒素脱除技术开发具有重要的意义。

目前，去除ZEN的方法主要有：物理法、化学法和生物法。物理法包括机械分离处理、高温、放射处理或吸附剂等；化学法是通过酸碱溶液或其他化合物对毒素进行处理。传统的物理和化学方法虽能清除部分真菌毒素，但存在诸多缺点，如降低粮食及饲料的营养价值，存在二次污染风险，在大批量的粮食和饲料加工工艺中应用难度大等。与上述方法相比，生物法主要是利用微生物或其代谢产物进行毒素降解的过程，具有对原料的感官性状、适口性、营养物质影响较小等优点，同时，还具有安全、环保、高效的特点，因此，利用生物法去除粮油或/饲料中ZEN的研究具有良好的应用前景。目前，研究报道表明多种真菌(例如，粉红粘帚霉、米根霉、匍枝根霉、少根根霉、黑曲霉、解毒毛孢酵母等)能够生物降解ZEN，但是关于细菌降解ZEN的报道仍较少。

CN103937681A公开了一株食品级黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用，将该黑曲霉在适宜的条件(28℃，菌液接种量2％)与终浓度为2ppm的ZEN共培养48h，ZEN的降解率为89.56％。CN103981134A公开了一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用，将该枯草芽孢杆菌在适宜的条件(28℃)下与终浓度为2ppm的ZEN共培养72h，ZEN的降解率为92.75％。CN103981133A公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用，将该株解淀粉芽孢杆菌在适宜的条件(28℃)下与终浓度为5ppm的ZEN共培养72h，ZEN的降解率为95.99％。可见，现有的微生物降解ZEN的方法降解时间均较长，且降解率尚有待提高。

另外，现有的降解ZEN的微生物大多是在温和的条件(如28℃，pH为7左右)下进行，然而，在较高的温度负荷下(如在容器中进行运输期间或在饲料粒化期间的情况下)或苛刻的酸碱性条件下尚无较好的解决办法，这就限制了生物法在降解ZEN中的应用范围。近年来，蛋白质定向进化技术如饱和突变、易错PCR、DNA改组等，对生物酶的已有性能改造提升及新功能开发应用起到了巨大推动作用。定向进化技术通过在实验室条件下模拟自然进化过程，从构建的突变体文库中筛选到满足特定需求的目标突变体，大大拓展了酶的应用范围。