[发明专利]一种精准定量的ATAC-seq文库制备方法及试剂盒

权利要求书

1.一种精准定量的ATAC-seq文库制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)提供两种衔接子，第一衔接子为5`-S1-S2-S3-S4-3`，第二衔接子为5`-S5-S6-S7-S8-3`，其中,所述S1为第一测序引物，S2为随机标签序列，S2的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S2的碱基的数量为15-30的任一整数，S3为固定序列，所述S4与S8的碱基序列相同，为Tn5转座子固定序列，S5为第二测序引物，S6为随机标签序列，S6的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S6的碱基的数量为15-100的任一整数，S7为固定序列；将所述两种衔接子与Tn5酶进行孵育得到转座复合体；

(b)再将转座复合体与测试样本进行孵育，得到扩增模板；

(c)将所述扩增模板进行PCR扩增，得到测序文库；

其中，所述方法包括选自下组的一个或多个特征：

(1)在步骤(a)中，所述S1为5`-TGTGAGAAATCTAGCATACGACTTCGTC-3`,S3为5`-GCGATCGC-3`,S4和S8的碱基序列为5`-AGATGTGTATAAGAGACAG-3`,S5为5`-CTGACTCCACACTGTAGAAGCCATGACACGG-3`,S7为5`-CACCGTGCTC-3`；

(2)在步骤(a)中，两种衔接子与Tn5酶混合前，将单链的第一衔接子和第二衔接子与单链M退火杂交形成双链衔接子，单链M的序列为5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3；将Tn5酶与合成的双链衔接子按照1：1的摩尔比进行混合，然后进行孵育，得到转座复合体；

(3)在步骤(b)中，转座复合体与测试样本进行孵育，得到含“衔接子-核酸-衔接子”复合物的混合物，将该混合物进行纯化，得到扩增模板；

(4)在步骤(c)中，将扩增模板用能够特异性结合于第一衔接子的第一引物Primer1和特异性结合与第二衔接子的第二引物Primer2进行PCR反应，获得扩增产物，其中，Primer1的结构为P1-I1-P2，P1为：5`-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3`，I1为测序标签序列，P2为:5`-ACACTCTTTAGATCGTATGCTGAAGCAG-3`，Primer2的结构为P3-I2-P4，其中P3为5`-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3`，I2为测序标签序列，P4为5`-GACTGAGGTGTGACATCTTCGGTACTGTGCC-3`。

2.如权利要求1所述的精准定量的ATAC-seq文库制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，测试样本为植物或动物的细胞核，测试样本的细胞核的数量为500-10000个。

3.如权利要求1所述的精准定量的ATAC-seq文库制备方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述I1选自：CTCTCTAT，TATCCTCT，AGAGTAGA，GTAAGGAG，ACTGCATA，AAGGAGTA，CTAAGCCT中的一种，所述I2选自：GCATGATC，TCCGTCTT，AGGACTCG，CCTGAGGA，ATCCGTAC，GAGAGATG，GTCTCTCC中的一种。

4.如权利要求1所述的精准定量的ATAC-seq文库制备方法，其特征在于，扩增产物需要进行纯化，然后得到测序文库。

5.如权利要求1所述的精准定量的ATAC-seq文库制备方法，其特征在于，所述测序文库进行片段长度范围检测和浓度定量后即可进行二代测序，然后进行数据分析。

6.一种精准定量的ATAC-seq文库制备试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一衔接子和第二衔接子，第一衔接子为5`-S1-S2-S3-S4-3`，第二衔接子为5`-S5-S6-S7-S8-3`，所述S1为第一测序引物，S2为随机标签序列，S2的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S2的碱基的数量为15-30的任一整数，S3为一固定序列，所述S4与S8的碱基序列相同，为Tn5转座子固定序列，S5为第二测序引物，S6的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S6的碱基的数量为15-100的任一整数，S7为另一固定序列。