[发明专利]一种双核苷酸条码报告基因分析系统、分析方法及应用

说明书

本发明具体涉及一种双核苷酸条码报告基因分析系统、分析方法及应用。现有高通量报告基因分析方法中，核苷酸标签具有偏好性，影响检测准确性。本发明提供了一种新型的双核苷酸报告基因分析系统，该系统使用双核苷酸作为标签，能够在大大降低偏好性的同时实现高通量报告基因分析。同时，DiR系统还能通过定量PCR的方法，结合标签特异性的引物，在常规通量水平对单个标签的表达进行定量，与传统荧光素酶报告基因分析系统相比，具有更高的灵敏度和稳定性。本发明通过所述分析系统对前列腺癌风险SNP位点的基因调控功能进行了分析，经筛选确定了多个功能调控位点。该DiR报告基因分析系统在基因调控活性分析，尤其是疾病风险相关基因变异位点的功能研究方面拥有巨大的潜力。

技术领域

本发明属于报告基因分析技术领域，具体涉及一种双核苷酸条码报告基因分析系统、基于该检测系统的报告基因分析方法及其在启动子、增强子分析领域的应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

全基因组关联研究(GWAS)提供了一种实用的方法来揭示遗传变异与复杂疾病之间的关系。具体而言，GWAS目录已收录了5000多种与癌症相关的风险SNP位点，但是，超过90％的癌症易感性SNP位点位于基因编码区之外，因此这使得对其功能机制的研究更具有挑战性。有报道表明，大多数风险SNP位于DNase I超敏位点(DHS)中，表现出染色质开放活性，这为其功能机制的研究奠定了基础。通常来说，具有基因调控功能的风险SNP位点通常影响转录因子在染色质上的结合，进而导致靶基因的异常表达，最终促使了癌症风险的发生。这些研究表明，风险SNP正在成为转化药物中癌症诊断和治疗的潜在标记物。

为了从大量风险变异位点中筛选出具有基因调控活性的SNP，本领域迫切需要一种高通量报告基因分析方法。目前，长度为10-20nt的DNA标签条码已被广泛应用于启动子和增强子的大规模筛选分析。然而，标签条码的核苷酸组成会不可避免地给报告基因表达水平带来偏倚，因此实际应用中通常需要为每个调控元件分配多达90个的标签，以减少偏好性对报告基因分析结果的影响。STARR-seq筛选方法是在NGS测序中使用自转录活性调控区作为其自身的标签，用于高通量筛选基因调控元件，但是仅能用于筛选与位置无关的增强子元件。因此，发明人认为，目前仍然缺乏一种不受条码偏爱性影响的高通量报告基因分析系统，无论基因调控元件以近距离还是以远距离的方式发挥作用，都能够准确评估其基因调控活性。

发明内容

针对上述研究背景，本发明提供了一种新的、使用双核苷酸条码的报告基因分析系统(DiR-seq系统)，以消除条码标签核苷酸组成带来的偏好性。该报告基因分析系统既可以与二代测序技术结合实现报告基因表达的高通量分析。同时，使用标签特异性的引物，还可以通过qPCR方法对单个标签的表达在常规通量水平进行定量。与现有的核苷酸标签系统以及荧光素酶报告基因分析系统相比，DiR-seq系统表现出了更好的一致性，以及更高的灵敏度和稳定性。在更好满足常规报告基因分析的同时，尤其有利于研究风险SNP位点等位基因之间的细微差异。

进一步的，本发明将DiR-seq应用于评估前列腺癌风险SNPs的基因调控功能，鉴定出了多个功能性风险SNPs位点。这也佐证了本发明提供的DiR系统表现出更高的准确性，稳定性和灵敏度，不仅可以应用于高通量筛选活性，也可以和荧光素酶分析一样进行常规通量的报告基因分析，具有极大的潜力，为促进各种复杂疾病相关风险SNP的研究奠定了坚实的基础。

基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种双核苷酸条码报告基因分析系统，所述分析系统采用双核苷酸条码区别各个基因调控元件，所述双核苷酸条码的构建方法如下：选取一段长度为400～600bp的DNA序列，去除其中的ATG密码子并优化GC含量至50-60％，所述优化后的DNA链插入质粒载体中作为报告基因载体质粒；

所述优化后的DNA链中，每个双核苷酸位置上设计四个两两互异的条码，即所述双核苷酸条码。