[发明专利]用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒

说明书

本申请属于肿瘤防治技术领域，具体涉及一种用于调节PD‑1/PD‑L1通路的RNAi表达质粒专利申请事宜。表达质粒shPD‑L1通过引物设计、PCR扩增、酶切、与pSicoR‑GFP vector连接、转化、筛选、鉴定等步骤制备获得。本申请通过构建靶向PD‑L1的RNAi质粒shPD‑L1，并将该质粒负载到带有正电荷的MSN‑NH₂的介孔中，并进一步利用挤压法制备成B16‑OVA细胞膜包裹的全抗原基因传递纳米载体CCM/MSN@shPD‑L1。该纳米载体不仅具有良好的生物相容性，同时可以同源靶向肿瘤细胞下调免疫检查点分子PD‑L1表达，重新激活CD8⁺ T细胞引发强烈的CTL免疫反应。

技术领域

本申请属于肿瘤防治技术领域，具体涉及一种用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒专利申请事宜。

背景技术

程序性死亡受体1（Programmed death 1），是一种重要的免疫抑制分子，它表达于肿瘤微环境中的免疫细胞，包括活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK）等，尤其高表达于CTL（细胞毒性T淋巴细胞）。PD-1有两个配体，分别是程序性死亡配体1（Programmed death ligand 1，PD-L1，也称为CD274或B7-H1）和程序性死亡配体2（Programmed death ligand 2， PD-L2；也称为CD273或B7-DC）。其中PD-L1是PD-1的主要配体，它主要表达于乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等肿瘤细胞。已有研究认为，PD-1 / PD-L1并不直接参与细胞凋亡途径，而是通过相互作用抑制T淋巴细胞的活化和增殖，间接影响肿瘤细胞的死亡。基于这些研究，借助于抗体的应用，通过阻断PD-1/PD-L1的相互作用在部分肿瘤的防控和治疗中已经表现出了较好应用效果。但抗体治疗的高剂量和长期应用需要，使得该技术成本高昂，而且容易“脱靶”，使得开发新的PD-1/PD-L1通路抑制药物仍然具有十分重要的技术意义。

RNA干扰作为基因功能研究的支撑技术，在医疗领域，已在各种由于基因活性改变导致的疾病中得到了初步应用，包括癌症、自身免疫性疾病、遗传性显性疾病等。RNAi可以高度特异性的调节靶基因，其在细胞中的主要作用是下调特定目标蛋白的表达。在基因治疗中，RNAi可以通过两种不同的途径触发：一种是基于RNA的方法，人工合成小干扰RNA（Small interfering RNAs，siRNAs），将其传递至靶细胞。siRNA通常是一段由21个核苷酸组成的双链RNA，它具有较好特异性RNAi触发活性。另一种是基于DNA的策略，合成更长的短发夹RNA（Short hairpin RNAs，shRNAs），进一步克隆到质粒载体中，并在靶细胞内被Dicer加工成siRNA，这使得构建RNAi质粒载体以沉默哺乳动物细胞内的基因表达成为可能。因此，如能基于RNA干扰技术开发一种针对现有PD-1和PD-L1抗体治疗的替代性技术，对于相关疾病的治疗是具有积极的技术意义的。但实际技术开发而言，尽管RNAi技术原理较为成熟，但如何将所构建的siRNAs或者shRNA输送到患病部位，则是该技术能否实现预期的关键。

现有技术中，以相关纳米材料作为载体来运输和携带相关药物已有较多研究。其中聚乙烯亚胺（PEI）即是一种研究得较为广泛的RNAi递送系统。然而，由于其不良的毒性和体内不稳定性（尤其是在全身给药期间），限制了其进一步的临床应用。近年来，一些无机纳米生物材料，如介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）、金纳米颗粒（Aus）、碳纳米管（CNT）等在生物医药中的应用研究得到了较多重视。其中，具有中孔结构的介孔二氧化硅纳米粒子（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）更是由于具有较大的表面积、可调节的孔径体积等可以增加其对药物分子和抗原的负载量的技术优势，得到了更多关注。因此，在确保应用效果基础上，如能基于现有纳米材料，结合RNA干扰技术开发一种新的PD-1/PD-L1通路调节技术，对于相关肿瘤的防控具有十分重要的科研意义和技术价值。

发明内容

本申请目的在于提供一种用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒，同时结合相关纳米载体的应用，可为相关肿瘤防治奠定一定技术基础。