[发明专利]一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母及其应用

说明书

本发明公开了一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母，命名为酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M‑15，已于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.20436。本发明还公开了所述酿酒酵母在以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料发酵生产二代燃料乙醇中的应用。实验证实本发明的菌株在能够耐受多重抑制物的同时，还具备了C6/C5高效共发酵能力，并且能够消耗完全部的葡萄糖和木糖生成乙醇，其糖醇转化率为0.43g g^‑1。本发明的菌株和采用的筛选策略为进一步选育发酵性能更优的二代燃料乙醇生产的酿酒酵母菌株提供了技术参考与基础。

技术领域

本发明涉及一种C6/C5共发酵酿酒酵母及其应用，尤其涉及一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

木质纤维素类生物质是地球上最丰富的可再生能源，年产量超过10¹³吨。随着石化资源的日益枯竭和环境污染问题，发展以木质纤维素类生物质为原料的生物基能源技术是实现能源转型的重要措施之一，也是世界范围内新能源格局的重要部分。以木质纤维类生物质为原料，通过微生物细胞工厂转化生产清洁液体燃料和化学品，是生物基能源技术的重要路径。木质纤维素因其化学结构坚固致密难以被微生物直接利用，因而需对原料进行必要的水解处理以释放微生物可直接利用的糖类组分。然而，木质纤维素水解液的化学成分较为复杂，同时含有六碳糖、五碳糖等糖类组分，以及弱酸类、呋喃类和酚类等非糖组分抑制物。其中，非糖组分抑制物通常对发酵微生物的生长和代谢具有抑制作用。因此，依据木质纤维素水解液组分特点，发酵微生物在性能上必须具备两个特点，即高效的六碳糖/五碳糖共发酵能力和较高的抑制物鲁棒性。

二代燃料乙醇是以木质纤维素为原料生产的乙醇，是国际上公认的替代化石能源的理想液体燃料之一。作为乙醇生产的主要发酵微生物，酿酒酵母因其强大的己糖发酵能力、鲁棒性以及成熟的基因操作技术，被认为是转化木质纤维素水解产物生产燃料乙醇的最具潜力的工业菌株之一。然而，野生型酿酒酵母由于缺乏戊糖(例如木糖)代谢的关键途径，只有极其微弱的戊糖代谢能力。木糖是木质纤维素类生物质中含量第二高的戊糖，其能否高效利用是提高原料底物转化效率和燃料乙醇经济盈利性的关键环节之一。为了提高酿酒酵母的木糖利用能力，国内外科学家开展了大量的工作，主要包括：1)木糖代谢起始途径的异源引入，即木糖还原酶-木糖醇脱氢酶(XR-XDH)途径和木糖异构酶(XI)途径；2)木糖代谢内源途径代谢优化；3)细胞内辅因子代谢平衡优化；4)特异性高效木糖转运蛋白筛选；5)适应性进化工程等。经过研究者们的不懈努力，酿酒酵母的纯品木糖代谢能力已基本达到葡萄糖的代谢水平。虽然酿酒酵母具备了葡萄糖和木糖共利用的能力，但其对木质纤维素水解液中抑制物的抗性仍然较低，而抑制物鲁棒性亦是影响微生物生长和代谢效率的重要因素。近十年来，科学家通过改造细胞内抑制物抗性响应途径等理性改造策略，以及随机突变和适应性进化等非理性策略，在一定程度上提高了细胞对单一抑制物的抗性。然而，对存在于木质纤维素水解液中多种类抑制物的协同抑制效应，即使较低浓度的混合抑制物亦可表现出较强的抑制作用。在研究过程中，包括申请人团队在内的国内外研究者发现，酿酒酵母在提高抑制物抗性的同时，其木糖代谢能力出现了不同程度的下降，似乎这两种性状存在此消彼长的拮抗关系。因此，在细胞内同时获得高木糖代谢和高鲁棒性这两种特性对选育二代燃料乙醇生产菌株带来了不小的挑战。

申请人在前期工作中，基于牛瘤胃宏基因组中筛选得到高活性木糖异构酶和来自Meyerozyma guilliermondii的特异性木糖转运蛋白MGT05196N360F，通过理性代谢工程及适应性进化工程构建了一株葡萄糖/木糖高效共利用重组酿酒酵母菌株，但其在含较高抑制物浓度的玉米秸秆水解液中鲁棒性较差。申请人实验发现在提高该菌株抑制物鲁棒性的研究中，鲁棒性提高的同时，木糖代谢明显下降，上面提到的拮抗关系再次出现。经检索，针对菌株中木糖代谢和鲁棒性之间的拮抗性，在酿酒酵母中目前有关消除或缓解这一拮抗性的专利和相关文献尚未见报道。

发明内容